在選用支原體PCR法檢測來替代藥典方法時，需要考慮如下兩個方面：

首先一步是要使用符合歐洲藥典要求，經過全方面驗證的支原體檢測試劑盒，第二部是自我驗證，即確認所用的樣本基質對于該試劑盒方法是合適的，并且操作過程是正確的。小規(guī)模的室內驗證通常需要采用三個不同批次的試劑盒，然后加入10CFU的標準品，做復孔（通常是8個復孔），并且至少選擇3個支原體物種進行驗證。

有的支原體標準品廠家會提供CFU與基因拷貝數的比值，以方便二者的換算。因為10CFU只能確定PCR能夠達到的檢測限在10CFU以下，但無法具體確定靈敏度的數值。帶DNA拷貝數標定的基因組DNA標準品則可進一步確定檢測限的數值。

總之，PCR方法很有用，但需要避免假陰性，驗證時應使用陽性對照、陰性對照、無模板對照和內控對照，以保證PCR反應正常，以及支原體少量存在時確實能檢出來，支原體不存在時也確保是結果陰性，從而使得PCR方法在工業(yè)應用時能確保zui終結果的可靠。

植物ＤＮＡ的ＳＤＳ提取法：1 取2-3ｇ新鮮葉片,在液氮中研磨成粉狀(防止溶化)后轉入15ｍｌ離心管中。2 加入5ｍｌ于65℃預熱的提取緩沖液,65℃水浴保溫30ｍｉｎ(搖動數次),使提取液與樣品充分混合。3 加入2ｍｌ5ｍｏｌ/ＬＫＡｃ,劇烈振蕩,冰浴保溫20ｍｉｎ以上。4 2700×ｇ離心20ｍｉｎ,將上清液倒入新的15ｍｌ離心管中,(若提?。模危劣糜冢樱铮酰簦瑁澹颍畹葘嶒?一般在轉移上清時加濾膜,防止樣品殘渣混入,可保證ＤＮＡ純度)。5 加入4ｍｌ氯1仿/異戊1醇(24∶1),搖勻,平衡,2700×ｇ離心15ｍｉｎ。6 在另一新的15ｍｌ離心管中加入5ｍｌ預冷的異丙1醇,將上清液用移液槍轉入此管,在-20℃冷卻30ｍｉｎ以上。7 2700×ｇ離心10ｍｉｎ,棄去上清液,用4ｍｌ70%乙醇洗滌,室溫保持10ｍｉｎ。2700×ｇ離心3ｍｉｎ,倒去上清液。8 重復步驟7,用4ｍｌ70%乙醇洗滌,室溫保持10ｍｉｎ。2700×ｇ離心3ｍｉｎ,倒去上清液。超凈工作臺內吹干(3ｈ左右)。9 加1ｍｌＴＥ緩沖液中溶解,加10μｌＲＮａｓｅ(10ｍｇ/ｍｌ),在37℃恒溫箱中溫育20ｍｉｎ。10 再加100μｌ3ｍｏｌ/ＬＮａＡｃ和2ｍｌ無水乙醇,2700×ｇ離心3ｍｉｎ,倒去上清液。超凈工作臺內吹干(3ｈ左右)。11 將ＤＮＡ沉淀溶于150μｌＴＥ中,置于超凈工作臺內(3ｈ左右)。將ＴＥ溶液轉入已滅菌的1 5ｍｌｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中,-20℃保存?zhèn)溆谩?

棉花等酚類、多糖類物質較多的植物ＤＮＡ提取法：

1 取2ｇ新鮮幼嫩的葉片放入研缽中,加入液氮后快速、充分研磨,待成極細的粉末狀時迅速轉入到50ｍｌ離心管中。

2 在50ｍｌ離心管中加入10ｍｌ冰預冷的提取緩沖液,在渦懸振蕩器上充分混勻。

3 于4℃,2700×ｇ離心20分鐘,倒去上清液。

4 在沉淀中加入5ｍｌ裂解緩沖液,在渦旋振蕩器上充分混勻。

5 于65℃水浴鍋中溫育30ｍｉｎ。

6 加入5ｍｌ氯1仿/異戊1醇(24/1),并上下翻轉以充分混合。

7 于4℃,2700×ｇ離心5分鐘。

8 轉移上層水相至一新的50ｍｌ離心管中。

9 重復步驟7-9一次。

10 加入2/3體積的冰預冷的異丙1醇,并上下翻轉以充分混合,至-20℃2ｈ。

11 于4℃,1200×ｇ離心10ｍｉｎ。

12 在一新管中加入20ｍｌ含80%乙醇15ｍｍｏｌ/ＬＮａＡｃ溶液,用玻棒將ＤＮＡ轉入該管(如不能直接用玻棒纏出,可離心后倒出上清,再在其中加入20ｍｌ含80%乙醇15ｍｍｏｌ/ＬＮａＡｃ溶液),放置20ｍｉｎ后稍許離心,移走上清并吸出殘存乙醇,室溫干燥。

13 加入1 0ｍｌＴＥ(10ｍｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ-ＨＣｌＰＨ=8 0,1ｍｍｏｌ/ＬＥＤＴＡ)并加入終濃度為20(ｇ/Ｌ的ＲＮａｓｅＡ,過夜。

14 風干,用50μｌＴＥ緩沖液溶解,存于-20℃?zhèn)溆谩?br />

鼻咽拭子的采集

被采集人員需要 保持頭部不動，采樣人員去除鼻腔內壁的分泌物。然后采樣人員一手輕扶被采集人員頭部，一手將鼻咽拭子緩緩插入鼻腔至鼻咽部。在鼻咽部，拭子將停留數秒吸取分泌物，而后采樣人員輕輕旋轉取出拭子，將樣本保存并送檢。

咽拭子的采集

被采集人員先用 生理鹽水漱口，采樣人員將拭子放入無菌生理鹽水中濕潤。被采集人員頭部微仰并保持不動，嘴張大，并發(fā)“啊”音，露出兩側咽扁桃體，采集人員將拭子越過舌根，在被采集者兩側咽扁桃體稍微用力來回擦拭至少3次，然后再在咽后壁上下擦拭至少3次。

需要注意的是，兩種采集方法， 被采集人員均會稍感不適，所以在采樣的過程中，被采集人員需稍稍克服一下不適感， 配合采樣人員的工作。不可過度活動頭部，以免拭子劃傷粘膜。如被采集人員發(fā)生刺激性咳嗽，采集過程需稍作暫停。