分子實驗介紹——熒光定量PCR檢測

熒光定量PCR是檢測生物樣品中RNA含量的普遍的方法，通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產物進行標記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應過程，結合相應的軟件可以對產物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。目前主要使用Sybr green和taqman法對RNA含量進行檢測。Sybr green在低樣本量時成本較低，目前選用的較多。證實試驗:將產氣管培養(yǎng)物接種煌綠乳糖膽鹽(BGLB)肉湯管中，36士1°C培養(yǎng)48士2h，觀察是否產氣。

SYBR Green I是一種只與DNA雙鏈結合的熒光染料。當它與DNA雙鏈結合時，發(fā)出熒光；從DNA雙鏈上釋放出來時，熒光信號急劇減弱。因此，在一個體系內，其信號強度代表了雙鏈DNA分子的數量。SYBR Green熒光染料法定量PCR的基本過程是：1、開始反應，當SYBR Green染料與DNA雙鏈結合時發(fā)出熒光。2、DNA變性時，SYBR Green染料釋放出來，熒光急劇減少。3、在聚合延伸過程中，引物退火并形成PCR產物。4、聚合完成后，SYBR Green染料與雙鏈產物結合，定量PCR系統檢測到熒光的凈增量加大。置于玻璃勻漿器中，加入1ml的細胞裂解緩沖液勻漿至不見組織塊，轉入1。

實驗流程：細胞或組織RNA提取-RNA濃度檢測-RNA逆轉錄-定量PCR檢測。

結果示例：

圖 A 基因擴增曲線圖；B 基因擴增溶解曲線圖；C mRNA相對表達量變化

從圖中可以擴增曲線可以看出目的RNA擴增效果，溶解曲線可以看出引物識別特異性情況，通過使用ΔΔCt方法計算可以得到每個組中目的mRNA表達變化。

動物組織細胞基因組DNA提取

操作步驟

1. 取新鮮或冰凍動物組織塊0.1g（0.5cm3），盡量剪碎。置于玻璃勻漿器中，加入1ml的細胞裂解緩沖液勻漿至不見組織塊，轉入1.5ml 離心管中，加入蛋白酶K

（500ug/ml）20μl，混勻。在65℃恒溫水浴鍋中水浴30min，也可轉入37℃水浴12～24h，間歇振蕩離心管數次。于臺式離心機以12000 rpm離心5min，取上清液入另

一離心管中。

2.加2倍體積異，倒轉混勻后，可以看見絲狀物，用100ul 吸頭挑出，涼干，用200ul TE 重新溶解。（可進行PCR反應等，需要進一步純化的按下列步驟進行）

3.加等量的酚??振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。

4.取上層溶液至另一管，加入等體積的?，振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。

5. 取上層溶液至另一管，加入1/2體積的7.5mol/L氨加入2倍體積的無水乙醇，混勻后室溫沉淀2min ，離心12000 rpm ,10min。

6.小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉。

7.用1ml 70%乙醇洗滌沉淀物1次，離心12000 rpm ， 5min。

8.小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉，室溫干燥。

9.加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?C20℃保存?zhèn)溆谩?

10.吸取適量樣品于GeneQuant上檢測濃度和純度。

甲l基化特異性的PCR

Herman 等（ 1996 ）在使用重亞硫酸鹽處理的基礎上新建的一種方法。該方法敏感性高，主要用于作定性研究。用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發(fā)生jia基化的胞嘧定被轉化為尿嘧ding，而jia基化的胞嘧定不變；不同個體之間在一個同源STR位點的重復次數也不同，因而同指紋識別一樣，STR位點分析也可對個體進行身份識別。隨后設計針對jia基化和非jia基化序列的引物進行PCR。通過電泳檢測MSP擴增產物，如果用針對處理后jia基化DNA鏈的引物能得到擴增片段，則說明該位點存在jia基化；反之，說明被檢測的位點不存在jia基化。

特點：適用范圍廣，能夠檢測特異位點是否發(fā)生jia基化。

亞硫酸氫鹽測序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）

亞硫酸氫鹽修飾后測序法（ BSP ） Frommer 等（ 1992 ）提出的研究 DNA jia基化方法，此方法可靠性及jing確度高，能明確目的片段中每一個 CpG 位點的jia基化狀態(tài)。用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發(fā)生jia基化的胞嘧ding被轉化為尿嘧ding，而jia基化的胞嘧ding不變。隨后設計BSP引物進行PCR，在擴增過程中尿嘧定全部轉化為胸腺嘧定，zui后對PCR產物進行測序就可以判斷CpG位點是否發(fā)生jia基化，稱為BSP-直接測序法。將PCR產物克long至載體后進行測序，可以提高測序成功率，這種方法稱為BSP-ke隆測序法。腺相關病毒的滴度在10^12~10^13GC/ml,可以滿足各類整體實驗的使用要求。

特點：jing確度高，能夠準確檢測出jia基化的程度百分比。

STR檢測

短串聯重復(Short tandem repeats, STR)，又稱微wei星DNA(Microsatellite DNA)或簡單重復序列(Simple repeat sequence, SRS或SSR)，是廣泛存在于原核生物和真核生物基因組中的核苷酸重復序列。有絲分裂過程中DNA鏈之間的錯配引起的fu制滑動被認為是導致STR產生的較為常見原因，并且依據不同fu制單元大小的不同以及不同物種之間，fu制滑動發(fā)生的概率也不相同。近年來，分子生物學檢測技術的方法學研究取得了進展，先后建立了各種分子生物學檢測技術。

STR是以核心序列 (core repeat units) 首尾相連多次重復形成。每個STR的核心序列結構相同，長度為2-6bp，但其重復單位數目和重復區(qū)域的長度不同，因此STR在不同種族、不同人群之間的分布具有差異性，構成了STR遺傳多態(tài)性。不同個體之間在一個同源STR位點的重復次數也不同，因而同指紋識別一樣，STR位點分析也可對個體進行身份識別。通過識別個體基因組在特定位點的特定序列重復，即可創(chuàng)建其基因檔案。將PCR產物克long至載體后進行測序，可以提高測序成功率，這種方法稱為BSP-ke隆測序法?；诖?，STR分析法已經成為一種重要的鑒定分析方法，應用于法醫(yī)學、qin子鑒定及細胞鑒定等領域。