Cell Counting Kit-8（簡稱CCK-8）是一種基于WST-8的廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的檢測試劑。WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧ji-4-硝ji苯j(luò)i)-3-(4-硝ji苯j(luò)i)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，是一種類似于MTT的化合物，它在電子載體1-甲氧ji-5-甲ji吩嗪鎓硫酸二jia酯（1-Methoxy PMS）存在的情況下，被線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的橙黃色甲瓚產(chǎn)物（formazan）。細(xì)胞增殖越多越快，顏色越深；細(xì)胞分化的本質(zhì)是基因組在時間和空間上的選擇性表達(dá)，通過不同基因表達(dá)的開啟或關(guān)閉，終產(chǎn)生標(biāo)志性蛋白質(zhì)。細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺，對于同樣的細(xì)胞，顏色的深淺與活xi胞的數(shù)量成正比，因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。

大鼠shen小球內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)

2.原代細(xì)胞培養(yǎng):(1)shen臟原位灌洗:SD大鼠用25%烏拉坦腹整注射麻zui后仰臥固定。胸腹部消森并分離胸主動脈,以無菌的冷Hank液漱朱洗血.同時剪破shen靜脈利于液體流出。1-2min后shen臟色澤變白,取出雙shen冰浴保存。脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染1、細(xì)胞H9C2(Hela)6孔板Hela1x10°/孔。

(2)shen小球分離:參照Green等方法改進(jìn)。將灌洗后的shen臟撕下shen被膜.去除髓質(zhì)后將皮質(zhì)剪成約1-2mm'的碎塊，輕碾shen皮質(zhì)依次通過80.120和200目鋼篩。收集shen小球。

(3)shen小球消化和培養(yǎng)；調(diào)亡I期(pro-apoptosisnuclei)的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象(cavitati)的空泡結(jié)構(gòu)。將提取的shen小球加人0.1% IN 型膠原酶消化后收集沉淀。以2x10* 的shen小球數(shù)接種于鋪有1%明膠培養(yǎng)瓶內(nèi),加A配制好的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液(MFM.Hepes 20 mmnoVL 20%胎牛xue清0. 66 U胰島素/ml.血管內(nèi)皮生長因子20 ng /ml、肝素鈉100 u/ml.青莓su100 U/ml、鏈霉su100 μ/ml) .靜止培養(yǎng)3 d后逐日觀察shen小球的貼壁情況。待shen小球充分貼壁后常規(guī)換液.第3同進(jìn)行純化。

三、自噬過程進(jìn)行觀察和檢測

1、觀察自噬體的形成

由于自噬體屬于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，普通光鏡下看不到，因此，直接觀察自噬體需在透射電鏡下。Phagophore的特征為:新月狀或杯狀，雙層或多層膜,有包繞胞漿成分的趨勢。自噬體(AV1 )的特征為:雙層或多層膜的液泡狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)含胞漿成分，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等。自噬溶酶體(AV2 )的特征為:單層膜，胞漿成分己降解。電鏡形態(tài)學(xué)觀察法是一種比較經(jīng)典、可靠的方法，被認(rèn)為是確定細(xì)胞凋亡的金標(biāo)準(zhǔn)。( autophagic vacuolo AV )

2、在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋 白來示蹤自噬形成由于電鏡耗時長，不利于監(jiān)測(Monitoring) 自噬形成，人們利用LC3在自噬形成過程中發(fā)生聚集的現(xiàn)象開發(fā)出了此技術(shù)。無自噬時，GFP-LC3融合蛋 白彌散在胞漿中;自噬形成時，GFP-LC3融合蛋白轉(zhuǎn) 位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色熒光斑點，一個斑點相當(dāng)于一個自噬體，可以通過計數(shù)來評價自噬活性的高低。其檢測原理為活xi胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。

3、利用Western Blot檢測LC3-II/比值的變化以評價自噬形成自噬形成時，胞漿型LC3 (即 LC3-I)會酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)?自噬體)膜型(即LC3-ID，因此，LC3-II/比值 的大小可估計自噬水平的高低。(注意: LC3對LC3-II有更高的親和力，會造成假陽性。方法2和3需結(jié)合使用，同時需考慮溶酶體活性的影響。將上層細(xì)胞懸液倒入一個裝有10mlMEF生長培養(yǎng)基的50ml離心管中，用200目的尼龍網(wǎng)過濾后，以1500rpm離心5分鐘收集細(xì)胞，再用30mlMEF生長培養(yǎng)基洗滌兩次。)

4、MDC (Monodansylcadaverine ，單丹磺酰尸胺)染色:包括自噬體，所有酸性液泡都被染色，故屬于非特異性的。

5、CellTrackerTM Green染色:主要用于雙染色，但其能染所有的液泡，故也屬于非特異性的。

細(xì)胞分化

細(xì)胞分化是指同一來源的細(xì)胞逐漸產(chǎn)生出形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能特征各不相同的細(xì)胞類群的過程，其結(jié)果是在空間上細(xì)胞產(chǎn)生差異，在時間上同一細(xì)胞與其從前的狀態(tài)有所不同。細(xì)胞分化的本質(zhì)是基因組在時間和空間上的選擇性表達(dá)，通過不同基因表達(dá)的開啟或關(guān)閉，終產(chǎn)生標(biāo)志性蛋白質(zhì)。細(xì)胞誘導(dǎo)是指將一群不同類型或者形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能特征存在差異的細(xì)胞通過生物學(xué)、物理學(xué)等手段，將之轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂邢嗨?相同形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能特征的細(xì)胞群體的過程。通常利用AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)來區(qū)分凋亡和壞死細(xì)胞。