原位雜交技術基本原理

原位雜交技術的基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補的堿基序列，將有放6射性或非放6射性的外源核酸(即探針)與組織、細胞或染色體上待測DNA或RNA互補配對，結合成專一的核酸雜交分子，經一定的檢測手段將待測核酸在組織、細胞或染色體上的位置顯示出來。

為顯示特定的核酸序列必須具備3個重要條件：組織、細胞或染色體的固定、具有能與特定片段互補的核苷酸序列(即探針)、有與探針結合的標記物。

總的來說，隨探針濃度增加，雜交率也增加。另外，在較窄的范圍內，隨探針濃度增加，敏感性增加。依我們的經驗，要獲得較滿意的敏感性，膜雜交中32P標記探針與非放0射性標記探針的用量分別為5～10 ng/ml和25～1000ng/ml，而原位雜交中，無論應用何種標記探針，其用量均為0.5～5.0μg/ml。探針的任何內在物理特性均不影響其使用濃度，但受不同類型標記物的固相支持物的非特異結合特性的影響。



根據(jù)不同的雜交實驗要求，應選擇不同的核酸探針。在大多數(shù)情況下，可以選擇克0隆的DNA或cDNA雙鏈探針。但是在有些情況下，必須選用其它類型的探針如寡核苷酸探針和RNA探針。例如，在檢測靶序列上的單個堿基改變時應選用寡核苷酸探針，在檢測單鏈靶序列時應選用與其互補的DNA單鏈探針（通過克0隆人M13噬菌體DNA獲得）或RNA探針，寡核苷酸探針也可。長的雙鏈DNA探針特異性較強，適宜檢測復雜的靶核苷酸序列和病原體 ，但不適宜于組織原位雜交，因為它不易透過細胞膜進入胞內或核內。在這種情況下，寡核苷酸探針和短的PCR標記探針（80～150bp）具有較大的優(yōu)越性。