水中微生物DNA提取試劑盒，樣本制備步驟。

步驟1. 樣本過濾

1.1 從試劑盒中小心取出濾膜。用水樣潤(rùn)濕濾膜。

1.2 將濾膜放置在濾器中，并過濾必要體積的水樣。

步驟2. 菌體裂解

* 提前準(zhǔn)備：預(yù)先將恒溫儀設(shè)置到70℃，將恒溫箱設(shè)置到37℃。

2.1將樣本過濾后的濾膜翻轉(zhuǎn)放置到試劑盒提供的IncubationDish（平皿）中。

2.2 吸取2mllysis buffer（裂解液），并加到濾膜上。

2.3 將濾膜浸泡在裂解液中，小心搖勻平皿并在37°C孵育30分鐘。

2.4 用平皿中的裂解液沖洗濾膜，并搖晃平皿10秒鐘。

2.5 將平皿中的400μl裂解液轉(zhuǎn)移至IncubationTube（孵育管），70°C孵育10分鐘。

2.6 樣本短暫離心，并加入400μl Binding Buffer（結(jié)合液），立即渦旋充分混勻，以防止DNA沉淀。請(qǐng)勿離心樣本，并立即進(jìn)行下一步。

步驟3. DNA提取

3.1 將步驟2.6中的混合液（~800μl）轉(zhuǎn)移到CollectionTube（收集管）內(nèi)的SpinColumn（離心柱）中，小心液體不要沾到離心柱的邊緣。

3.2 離心柱離心≥10000× g，1分鐘。棄掉收集管中的液體。重新將離心柱插到原有的收集管中。

3.3 離心柱中加入500μl洗液1。離心≥10000×g，1分鐘。棄掉收集管中的液體。重新將離心柱插到原有的收集管中。

3.4 離心柱中加入500μl洗液2。離心≥10000×g，1分鐘。棄掉收集管中的液體。將離心柱插到一個(gè)新的收集管中。

3.5 zui大速度離心3分鐘，以去除殘留的洗液2。

3.6 棄掉收集管。

3.7 吸取60μl已70℃預(yù)熱的洗脫液，直接加到離心柱的硅膠膜上。硅膠膜表面應(yīng)全部覆蓋洗脫液。

3.8 室溫靜置2分鐘，然后離心8000×g，2分鐘，以洗脫DNA。

3.9 樣本保存管中的洗脫液即包含DNA，可直接用于PCR，或儲(chǔ)存在2~8℃，可存放1周。長(zhǎng)期儲(chǔ)存是在≤-18℃。

DNA提取過程中各種試劑的作用及原理

溶液II-NaOH-SDS液：NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是穩(wěn)定的。但當(dāng)pH>12或pH<3時(shí)，就會(huì)引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。 在溶液II中的NaOH濃度為0.2mo1/L，加抽提液時(shí)，該系統(tǒng)的pH就高達(dá)12.6， 因而促使染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性。

　　SDS：

　　SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有：

　　(1)溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜。

　　(2)解聚細(xì)胞中的核蛋白。

　　(3)SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-SO3-…R -蛋白質(zhì)的復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。 但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取過程中，必須把它去除干凈，防止在下一步操作中 (用RNase去除RNA時(shí))受到干擾。

病毒核酸提取就像'針尖上跳舞'

檢驗(yàn)的首要一步是病毒核酸提取，這也是zui危險(xiǎn)的一步，需要在專門的生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室里進(jìn)行。檢測(cè)人員要在清潔區(qū)穿戴兩套防護(hù)服、兩副乳膠手套，戴護(hù)目鏡，穿靴套，前后穿過6道門，才能到達(dá)核心實(shí)驗(yàn)區(qū)，病毒核酸提取就像是“針尖上的舞蹈”?！懊看蚊撓路雷o(hù)服，衣服都濕透了。在2—4個(gè)小時(shí)的病毒核酸提取實(shí)驗(yàn)過程中，一般都會(huì)安排兩人一組進(jìn)行檢驗(yàn)，既是規(guī)定要求，也是防止工作人員在密閉的負(fù)壓實(shí)驗(yàn)空間里出現(xiàn)意外。