測(cè)定步驟

I.主動(dòng)Arf 6下拉分析

1.將0.5 – 1 mL細(xì)胞裂解液等分到微量離心管中。

2.使用1X分析/裂解緩沖液將每個(gè)樣品的體積調(diào)整為1 mL。

3.在管中加入1 μl抗活性Arf 6單克l隆抗l體。

4.通過(guò)渦旋或滴定徹底重懸蛋白A / G瓊脂糖珠漿。

5.快速向每個(gè)管中添加20 μL重懸浮的珠漿。

6.輕輕攪拌將試管在4°C下孵育1小時(shí)。

7.通過(guò)以5,000 x g離心1分鐘來(lái)沉淀小珠。

8.吸出并丟棄上清液，確保不要干擾/除去珠粒。

9.用0.5 mL的1X Assay / Lysis Buffer洗滌磁珠3次，每次離心并吸出。

10.后一次洗滌后，將珠粒沉淀并小心除去所有上清液。

11.將磁珠沉淀重懸于20 μL 2X還原SDS-PAGE樣品緩沖液中。

12.將每個(gè)樣品煮沸5分鐘。

13.以5,000 x g的速度離心每個(gè)樣品10秒鐘。

 1.抗活性的Arl1，小鼠單克l隆抗l體（貨號(hào)26924）：一小瓶–溶于pH 7.4的PBS中的22 μL（1mg / ml），含有50％甘油和0.05％疊氮l化鈉。該抗l體特異性識(shí)別所有脊椎動(dòng)物的Arl1-GTP。

2.蛋白A / G瓊脂糖（目錄號(hào)30301）：一小瓶– 400 μL 50％漿液。

3. 5X測(cè)定/裂解緩沖液（目錄號(hào)30302）：一瓶– 30 mL的250 mM Tris-HCl，pH 8，750mM NaCl，50 mM MgCl2，5 mM EDTA，5％Triton X-100。

4.抗Arl1，小鼠單克l隆抗l體（目錄號(hào)26056）：一小瓶– 100 μL（1 mg / ml）

pH 7.4的PBS中含有50％的甘油。

5. 100 XGTPγS（貨號(hào)30303）：1瓶– 100 μl，10 mM，使用5 μLGTPγSGTP標(biāo)記的0.5 mL細(xì)胞裂解物。

6. 100 X GDP（產(chǎn)品目錄號(hào)30304）：一個(gè)樣品瓶– 100 μl，100 mM，使用5 μL GDP

GDP標(biāo)記的0.5 mL細(xì)胞裂解物。

1.刺激的和非刺激的細(xì)胞裂解液

2.蛋白酶抑制l劑

3. 4°C管搖桿或搖床

4. 0.5 M EDTA，pH8.0

5. 1 M氯化鎂

6. 2倍還原SDS-PAGE樣品緩沖液

7.電泳和免l疫印跡系統(tǒng)

8.免l疫印跡洗滌緩沖液，例如TBST（10 mM Tris-HCl，pH 7.4，0.15 M NaCl，0.05％Tween-20）

9.免l疫印跡封閉緩沖液（TBST包含5％脫脂奶粉或3％BSA）

10. PVDF或硝l酸纖維素膜

11.二抗

12. ECL檢測(cè)試劑

?1X測(cè)定/裂解緩沖液：短暫混合5X儲(chǔ)備液，并在去離子水中稀釋至1X。 在使用前，添加蛋白酶抑制l劑，例如1 mM PMSF，10 μg / mL亮肽素和10 μg / mL抑肽酶。

武漢紐斯特生物科技有限公司（WuhanNewEastBiotechonologyCo.Ltd），系美國(guó)生命科學(xué)試劑供應(yīng)商美國(guó)NewEastBio在中國(guó)的子公司。美國(guó)NewEastBio專注于生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，主要產(chǎn)品有小分子、ELISA試劑盒、蛋白等。

懸浮細(xì)胞

1.培養(yǎng)細(xì)胞并根據(jù)需要用活化劑或抑制l劑刺激。

2.進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后通過(guò)離心沉淀細(xì)胞。

3.吸出培養(yǎng)基，并用冰冷的PBS洗滌兩次。

4.完全除去PBS洗滌液，然后向細(xì)胞沉淀中加入冰冷的1X分析/裂解緩沖液

   （每1 x 107池0.5 – 1 mL）。

5.通過(guò)重復(fù)移液裂解細(xì)胞。

6.將裂解物轉(zhuǎn)移至適當(dāng)大小的試管中，并置于冰上。

7.如果發(fā)生核裂解，則細(xì)胞裂解液可能變得非常粘稠，難以移液。如果這

   發(fā)生時(shí)，裂解液可通過(guò)27?號(hào)注射l器針頭3-4次以剪切

   基因組DNA。

8.通過(guò)離心10分鐘（在4°C下為12,000 x g）清除裂解物。

9.收集上清液并將樣品保存在冰上以備立即使用，或速凍并保存在-

   70°C以備將來(lái)使用。

陽(yáng)性和陰性對(duì)照的體外GTPγS/ GDP蛋白質(zhì)上樣量

    注意：體內(nèi)刺激細(xì)胞會(huì)激l活大約10％的可用Rab35，而

    體外GTPγS蛋白負(fù)載將激l活近90％的Rab35。

1.將0.5 ml每種細(xì)胞提取物等分到兩個(gè)微量離心管中（或使用1 μg純化的Rab35蛋白）。

2.向每個(gè)試管中加入20 μl 0.5 M EDTA（至20 mM終濃度）。

3.將5 μl 100 XGTPγS（至100 μM，終濃度）加到一個(gè)試管中（陽(yáng)性對(duì)照）。

4.在第二個(gè)試管中加入5 μl 100 X GDP（至1 mM，終濃度）（陰性對(duì)照）。

5.在攪拌下將試管在30°C孵育30分鐘。

6.通過(guò)將試管放在冰上并添加32.5 μl 1 M MgCl2（至60 mM）。

電泳和轉(zhuǎn)移

1向聚丙l烯酰胺凝膠（17%）中加入15μL/孔的下拉上清液。而且建議包括預(yù)染色MW標(biāo)準(zhǔn)（作為成功轉(zhuǎn)入的指標(biāo)步驟3）。

2按照制造商的說(shuō)明進(jìn)行SDS-PAGE。

3按照制造商的說(shuō)明，將凝膠蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF或硝化纖維膜上說(shuō)明。

免l疫印跡檢測(cè)（所有步驟均在室溫下攪拌）

1在電印跡步驟之后，將PVDF膜浸入100%甲l醇中15次

然后在室溫下干燥5分鐘。

如果使用硝基纖維素，則應(yīng)跳過(guò)此步驟。

2室溫下用5%脫脂奶粉或3%牛血l清白蛋白在TBST中封閉1小時(shí)

不斷地?cái)噭?dòng)。

用抗Arl1單克l隆抗l體孵育，新鮮稀釋1:50~1000

（取決于樣品中Arl1蛋白質(zhì)的含量）5%脫脂奶粉或3%

BSA/TBST，室溫下持續(xù)攪拌1-2小時(shí)或4o

過(guò)夜。

3用TBST清洗吸水膜三次，每次5分鐘。

4用二級(jí)抗l體（例如山羊抗鼠IgG，HRP結(jié)合物）培養(yǎng)膜，

在室溫下，在5%脫脂奶粉或3%BSA/TBST中新鮮稀釋1:1000，1小時(shí)

5用TBST清洗吸水膜三次，每次5分鐘。

6使用您選擇的檢測(cè)方法，如ECL。