試劑準(zhǔn)備

?1X測(cè)定/裂解緩沖液：短暫混合5X儲(chǔ)備液，并在去離子水中稀釋至1X。 在使用前，添加蛋白酶抑制l劑，例如1 mM PMSF，10 μg / mL亮肽素和10 μg / mL抑肽酶。

1.將細(xì)胞（一塊10厘米長(zhǎng)的平板，約107個(gè)細(xì)胞）培養(yǎng)至約80-90％匯合。根據(jù)需要用活化劑或抑制l劑刺激細(xì)胞。

2.吸出培養(yǎng)基，并用冰冷的PBS洗滌兩次。

3.完全除去PBS洗滌液，然后向細(xì)胞中加入冰冷的1X分析/裂解緩沖液（每10 cm組織培養(yǎng)板0.5-1 mL）。

4.將培養(yǎng)板放在冰上10-20分鐘。

5.用刮板將其從平板上取下。

6.將裂解物轉(zhuǎn)移至適當(dāng)大小的試管中，并置于冰上。

7.如果發(fā)生核裂解，則細(xì)胞裂解液可能變得非常粘稠，難以移液。如果發(fā)生這種情況，可將裂解液通過27?號(hào)注l射器針頭3-4次以剪切基因組DNA。

8.通過離心10分鐘（在4°C下為12,000 x g）清除裂解物。

9.收集上清液并將樣品（約1-2 mg的總蛋白）存儲(chǔ)在冰上以立即使用，或速凍并存儲(chǔ)在-70°C以便將來使用。

 1.抗活性的Arl1，小鼠單克l隆抗l體（貨號(hào)26924）：一小瓶–溶于pH 7.4的PBS中的22 μL（1mg / ml），含有50％甘油和0.05％疊氮l化鈉。該抗l體特異性識(shí)別所有脊椎動(dòng)物的Arl1-GTP。

2.蛋白A / G瓊脂糖（目錄號(hào)30301）：一小瓶– 400 μL 50％漿液。

3. 5X測(cè)定/裂解緩沖液（目錄號(hào)30302）：一瓶– 30 mL的250 mM Tris-HCl，pH 8，750mM NaCl，50 mM MgCl2，5 mM EDTA，5％Triton X-100。

4.抗Arl1，小鼠單克l隆抗l體（目錄號(hào)26056）：一小瓶– 100 μL（1 mg / ml）

pH 7.4的PBS中含有50％的甘油。

5. 100 XGTPγS（貨號(hào)30303）：1瓶– 100 μl，10 mM，使用5 μLGTPγSGTP標(biāo)記的0.5 mL細(xì)胞裂解物。

6. 100 X GDP（產(chǎn)品目錄號(hào)30304）：一個(gè)樣品瓶– 100 μl，100 mM，使用5 μL GDP

GDP標(biāo)記的0.5 mL細(xì)胞裂解物。

1.刺激的和非刺激的細(xì)胞裂解液

2.蛋白酶抑制l劑

3. 4°C管搖桿或搖床

4. 0.5 M EDTA，pH8.0

5. 1 M氯化鎂

6. 2倍還原SDS-PAGE樣品緩沖液

7.電泳和免l疫印跡系統(tǒng)

8.免l疫印跡洗滌緩沖液，例如TBST（10 mM Tris-HCl，pH 7.4，0.15 M NaCl，0.05％Tween-20）

9.免l疫印跡封閉緩沖液（TBST包含5％脫脂奶粉或3％BSA）

10. PVDF或硝l酸纖維素膜

11.二抗

12. ECL檢測(cè)試劑

武漢紐斯特生物科技有限公司（WuhanNewEastBiotechonologyCo.Ltd），系美國(guó)生命科學(xué)試劑供應(yīng)商美國(guó)NewEastBio在中國(guó)的子公司。美國(guó)NewEastBio專注于生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，主要產(chǎn)品有小分子、ELISA試劑盒、蛋白等。

懸浮細(xì)胞

1.培養(yǎng)細(xì)胞并根據(jù)需要用活化劑或抑制l劑刺激。

2.進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后通過離心沉淀細(xì)胞。

3.吸出培養(yǎng)基，并用冰冷的PBS洗滌兩次。

4.完全除去PBS洗滌液，然后向細(xì)胞沉淀中加入冰冷的1X分析/裂解緩沖液

   （每1 x 107池0.5 – 1 mL）。

5.通過重復(fù)移液裂解細(xì)胞。

7.如果發(fā)生核裂解，則細(xì)胞裂解液可能變得非常粘稠，難以移液。如果這

   發(fā)生時(shí)，裂解液可通過27?號(hào)注射l器針頭3-4次以剪切

   基因組DNA。

9.收集上清液并將樣品保存在冰上以備立即使用，或速凍并保存在-

   70°C以備將來使用。

陽(yáng)性和陰性對(duì)照的體外GTPγS/ GDP蛋白質(zhì)上樣量

    注意：體內(nèi)刺激細(xì)胞會(huì)激l活大約10％的可用Rab35，而

    體外GTPγS蛋白負(fù)載將激l活近90％的Rab35。

1.將0.5 ml每種細(xì)胞提取物等分到兩個(gè)微量離心管中（或使用1 μg純化的Rab35蛋白）。

2.向每個(gè)試管中加入20 μl 0.5 M EDTA（至20 mM終濃度）。

3.將5 μl 100 XGTPγS（至100 μM，終濃度）加到一個(gè)試管中（陽(yáng)性對(duì)照）。

4.在第二個(gè)試管中加入5 μl 100 X GDP（至1 mM，終濃度）（陰性對(duì)照）。

5.在攪拌下將試管在30°C孵育30分鐘。

6.通過將試管放在冰上并添加32.5 μl 1 M MgCl2（至60 mM）。

分析原理

NewEast Biosciences Arl1激l活檢測(cè)試劑盒基于配置特異性抗Arl1-GTP從細(xì)胞提取物或體外檢測(cè)活性Arl1-GTP水平的單克l隆抗l體GTPγS負(fù)載Arl1活化分析。簡(jiǎn)而言之，抗活性Arl1小鼠單克l隆抗l體將用含有Arl1-GTP的細(xì)胞裂解液培養(yǎng)。然后，綁定的活動(dòng)Arl1將被下拉蛋白質(zhì)A/G瓊脂糖。用抗Arl1兔多克l隆抗l體或抗Arl1小鼠單克l隆抗l體進(jìn)行免l疫印跡分析，檢測(cè)沉淀的活性Arl1。

需要但未提供的材料

1刺激性和非刺激性細(xì)胞裂解物

2蛋白酶抑制素

4°C搖管器或振動(dòng)篩

40.5 M EDTA，pH8.0

51百萬(wàn)氯化鎂

62X還原SDS-PAGE樣品緩沖液

7電泳和免l疫印跡系統(tǒng)

8免l疫印跡洗滌緩沖液，如TBST（10 mM Tris HCl，pH 7.4，0.15 M NaCl，0.05%

吐溫-20）

9免l疫印跡阻斷緩沖液（含5%脫脂奶粉或3%牛血l清白蛋白的TBST）

10PVDF或硝化纖維膜

11次級(jí)抗l體

12ECL檢測(cè)試劑