低溫生物菌種為什么可以在零下保藏？

低溫生物菌種都是需要保護(hù)劑的，動(dòng)物細(xì)胞也可以。細(xì)菌結(jié)構(gòu)問題使得它比較容易保存，只用加10%左右的甘油就可以在-20攝氏度保存。動(dòng)物細(xì)胞需要加DMSO等，并且需要放到-80或者液氮才行冷凍保藏是指將菌種于-20℃以下的溫度保藏，通過冷凍，使微生物代謝活動(dòng)停止。就是通過低溫來抑制微生物的生命活動(dòng)，在保藏過程中，必須使微生物的代謝處于不活躍或相對(duì)靜止的狀態(tài)，才能在一定的時(shí)間內(nèi)使其不發(fā)生變異而又保持生活能力。低溫、干燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力降低的重要因素。

低溫生物菌種的液氮冷凍保藏法

(1)準(zhǔn)備安瓿管用于液氮保藏的安瓿管，要求能耐受溫度突然變化而不致破碎，因此，需要采用硼硅酸鹽玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用75×10mm的，或能容1.2mm液體的。

(2)加保護(hù)劑與滅菌保存細(xì)菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的細(xì)胞時(shí)，則將空安瓿管塞上棉塞，1.05kg/cm2，121.3℃滅菌15分鐘:若作保存霉菌菌絲體用則需在安瓿管內(nèi)預(yù)先加入保護(hù)劑如10%的甘油蒸餾水溶液或10%二甲亞砜蒸餾水溶液，加入量以能浸沒以后加入的菌落圓塊為限，而后再用1.05kg/cm2>，121.3℃滅菌15分鐘。

(3)接入菌種將菌種用10%的甘油蒸餾水溶液制成菌懸液，裝入已滅菌的安瓿管;霉菌菌絲體則可用滅菌打孔器，從平板內(nèi)切取菌落圓塊，放入含有保護(hù)劑的安瓿管內(nèi)，然后用火焰熔封。浸入水中檢查有無漏洞。

(4)凍結(jié)再將已封口的安瓿管以每分鐘下降1℃的慢速凍結(jié)至-30℃。若細(xì)胞急劇冷凍，則在細(xì)胞內(nèi)會(huì)形成冰的結(jié)晶，因而降低存活率。

(5)保藏經(jīng)凍結(jié)至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷凍保藏器(圖Ⅶ-14)的小圓筒內(nèi)，然后再將小圓筒放入液氮保藏器內(nèi)。液氮保藏器內(nèi)的氣相為-150℃，液態(tài)氮內(nèi)為-196℃。

(6)恢復(fù)培養(yǎng)保藏的菌種需要用時(shí)，將安瓿管取出，立即放入38-40℃的水浴中進(jìn)行急劇解凍，直到全部融化為止。再打開安瓿管，將內(nèi)容物移入適宜的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

此法除適宜于一般微生物的保藏外，對(duì)一些用冷凍干燥法都難以保存的微生物如支原體、衣原體、氫細(xì)菌、難以形成孢子的霉菌、噬菌體及動(dòng)物細(xì)胞均可長期保藏，而且性狀不變異。缺點(diǎn)是需要特殊設(shè)備。

低溫生物菌種的菌劑用法

微生物菌劑用量少，主要起調(diào)節(jié)作用。微生物菌劑的使用原則是“早，近，勻”使用時(shí)間早，離作物根系近，施用均勻。

⑴ 噴施 液體微生物菌劑含有固氮菌，光合細(xì)菌等微生物，可以用作葉面噴施，給植物增加營養(yǎng)，促進(jìn)光合作用。我們公司的微生物菌劑不適合作葉面噴施，因?yàn)橹饕煞质嵌喾N芽孢菌復(fù)合而成的。

⑵ 拌種 將種子放入清水中浸濕后撈出控干，隨后將本品揚(yáng)撒在種子上、混拌均勻，陰干后播種。使用種衣劑的種子應(yīng)拌種衣劑，后拌本品，陰干后播種，隨拌隨播。這種方法適合各種糧食種子。能促進(jìn)種子生長，減少病蟲害。

⑶ 浸種 菌劑：水以1：2的比例混合，攪拌后把種子放入菌液中，攪拌浸泡8—12小時(shí)，撈出陰干后播種。提高種子發(fā)芽率，增強(qiáng)抗病能力。

⑷ 蘸根 對(duì)于移栽作物，將本品兌適量水，蘸根后移栽即可。適用于有根的作物，在移栽時(shí)使用比較好。

⑸ 拌根 微生物菌劑可以和農(nóng)家有機(jī)肥混合，有機(jī)肥必須先充分腐熟后才能使用，否則會(huì)殺掉菌劑中的微生物。當(dāng)作種肥或底肥時(shí)，可將本品與化肥或有機(jī)肥拌在一起，隨肥料一起施用，須隨拌隨用，以免造成肥料融化而影響播肥質(zhì)量。

低溫生物菌種純化方法

1、傾注平板法

首先把微生物懸液通過一系列稀釋，取一定量的稀釋液與熔化好的保持在40~50°左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基充分混合，然后把這混合液傾注到無菌的培養(yǎng)皿中，待凝固之后，把這平板倒置在恒箱中培養(yǎng)。單一細(xì)胞經(jīng)過多次增殖后形成一個(gè)菌落，取單個(gè)菌落制成懸液，重復(fù)上述步驟數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)物 2、涂布平板法

首先把微生物懸液通過適當(dāng)?shù)南♂?，取一定量的稀釋液放在無菌的已經(jīng)凝固的營養(yǎng)瓊脂平板上，然后用無菌的玻璃刀把稀釋液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面上，經(jīng)恒溫培養(yǎng)便可以得到單個(gè)菌落。3、平板劃線法

簡單的分離微生物的方法是平板劃線法。用無菌的接種環(huán)取培養(yǎng)物少許在平板上進(jìn)行劃線。劃線的方法很多，常見的比較容易出現(xiàn)單個(gè)菌落的劃線方法有斜線法、曲線法、方格法、四格法等。當(dāng)接種環(huán)在培養(yǎng)基表面上往后移動(dòng)時(shí)，接種環(huán)上的菌液逐漸稀釋，然后在所劃的線上分散著單個(gè)細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)，每一個(gè)細(xì)胞長成一個(gè)菌落。

2、富集培養(yǎng)法

富集培養(yǎng)法的方法和原理非常簡單。我們可以創(chuàng)造一些條件只讓所需的微生物生長，在這些條件下，所需要的微生物能有效地與其他微生物進(jìn)行競爭，在生長能力方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他微生物。所創(chuàng)造的條件包括選擇合適的碳源、能源、溫度、光、pH、滲透壓和氫受體等。在相同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，經(jīng)過多次重復(fù)移種，然后富集的菌株很容易在固體培養(yǎng)基上長出單菌落。如果要分離一些專性寄生菌，就必須把樣品接種到相應(yīng)敏感宿主細(xì)胞群體中，使其大量生長。通過多次重復(fù)移種便可以得到純的寄生菌。