分子實驗介紹——熒光檢測

細(xì)胞熒光染色是以熒光物質(zhì)標(biāo)記而進(jìn)行抗原定位的技術(shù)。在細(xì)胞中，通過特定的標(biāo)記，可以檢測目的蛋白表達(dá)量和表達(dá)定位。是細(xì)胞中的可直觀觀察細(xì)胞內(nèi)蛋白定位和表達(dá)的實驗方法。

實驗流程：細(xì)胞固定-細(xì)胞膜破膜-蛋白封閉-目的蛋白結(jié)合-熒光二抗結(jié)合-DAPI染色-熒光顯微鏡拍照或激光共聚焦顯微鏡拍照。

結(jié)果示例：

細(xì)胞熒光染

通過觀察細(xì)胞中蛋白的熒光強(qiáng)度和定位分析該蛋白的表達(dá)變化。

單核苷酸多態(tài)性( SNP )實驗

SNP (Single Nucleotide Polymorphisn即單核苷酸多態(tài)性 ,是由于單個核苷酸改變而導(dǎo)致的核酸序列多態(tài)性(Polymorphism)。據(jù)估計,在人類基因組中,大約每千個堿基中有一個SNP ,無論是比較于度多態(tài)性(RFLP)分析還是微標(biāo)記(STR) ,都要廣泛得多。免yi共沉淀（Co-IP檢測）是以抗ti和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的方法。

實驗方法原理:

SNP (Single Nucleotide Polymorphisn即單核苷酸多態(tài)性,是由于單個核苷酸改變而導(dǎo)致的核酸序列多態(tài)性(Polymorphism)。據(jù)估計,在人類基因組中,大約每千個堿基中有一個SNP ,無論是比較于限制性段長度多態(tài)性(RFLP)分析還是微標(biāo)記(STR) ,都要廣泛得多。SNP是我們考察遺傳變異的單位,據(jù)估計,人類的所有群體中大約存在一千萬個SNP位點。-般認(rèn)為,相鄰的SNPs傾向于一起遺傳給后代。 于是,我們把位于染色體上某一區(qū)域的一組相關(guān)聯(lián)的SNP等位位點稱作單體型( haplotype b大多數(shù)染色體區(qū)域只有少數(shù)幾個常見的單體型(每個具有至少5%的頻率),它們代表了一個群體中人與人之間的大部分多態(tài)性。有絲分裂過程中DNA鏈之間的錯配引起的fu制滑動被認(rèn)為是導(dǎo)致STR產(chǎn)生的較為常見原因，并且依據(jù)不同fu制單元大小的不同以及不同物種之間，fu制滑動發(fā)生的概率也不相同。-個染色體區(qū)域可以有很多SNP位點,但是我們一-旦掌握了這個區(qū)域的單體型,就可以只使用少數(shù)幾個標(biāo)簽SNPs(tagSNP)來進(jìn)行基因分型,獲取大部分的遺傳多態(tài)模式。

分子與質(zhì)粒載體構(gòu)建

實驗原理

外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。RNAi提供了一種經(jīng)濟(jì)、快捷、gao效的抑制特異基因表達(dá)的技術(shù)手段,該技術(shù)已被廣泛用于研究基因功能和chuan染性疾病及惡xingzhong瘤基因zhi療領(lǐng)域。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下,有Mg2 、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源DNA分子進(jìn)行連接。DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸DNA連接酶。兩種DNA連接酶都有將兩個帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能，而且T4噬菌體DNA連接酶還有—種大腸連接酶沒有的特性，即能使兩個平末端的雙鏈DNA分子連接起來。但這種連接的效率比粘性末端的連接效率低，一般可通過提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來提高平末端的連接效率。

T4噬菌體DNA連接酶催化DNA連接反應(yīng)分為3步：，T4DNA連接酶與輔助因子ATP形成酶—AMP復(fù)合物；然后，酶—AMP復(fù)合物再結(jié)合到具有5’磷酸基和3’羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化；后產(chǎn)生一個新的磷酸二酯鍵，把切口封起來。

DNA重組的方法主要有粘端連接法和平端連接法，為了防止載體本身的自連，可以通過(牛堿性磷酸酶)CIP處理克服。

連接反應(yīng)的溫度在37℃時有利于連接酶的活性.但是在這個溫度下，粘性末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。因此人們找到了一個折中溫度，即12-16℃，連接12-16h(過夜)，這樣既可大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。

在玻璃燒杯中注入去離子水，加入DEPC使其終濃度為0.05%~0.1%（DEPC-H2O）。（DEPC二焦碳酸酯為活性很強(qiáng)的物，須在通風(fēng)櫥中小心使用）

將待處理的塑料制品放入一個可以高溫滅菌的容器中，注入DEPC-H2O，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中，在通風(fēng)柜中37℃ 或室溫下處理過夜。

將DEPC-H2O小心倒入廢液瓶中，將裝有DEPC- H2O 處理過的塑料制品的容器以鋁箔封口，高溫高壓蒸汽滅菌至少30分鐘。

滅菌塑料制品烘烤干燥，置潔凈處備用。

玻璃和金屬物品250 ℃烘烤3小時以上。