蛋白質(zhì)雙向電泳實(shí)驗(yàn)流程

1.三氯yi酸-bing酮沉淀法提取蛋白

2.雙向電泳分離待測樣品

(1)一相等電聚焦前處理按照所用儀器的廠商提供操作手冊進(jìn)行。蛋白質(zhì)上樣濃度不要超過10mg/mL,否則會造成蛋白質(zhì)的聚集或沉淀。

(2)等電聚焦完畢后(約需24hr），若不立即進(jìn)行第二相電泳，膠條可夾在兩層塑料薄膜中于-70℃保存數(shù)月。

(3)等電聚焦好的膠條按廠商提供的操作手冊平衡兩次。平衡完畢后，于電泳儀上用12.5%SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離。儀器設(shè)置為2.5W/膠 45min，15W/膠 5-8hr，20℃。

3.銀染法對凝膠進(jìn)行染色

(1)固定(2)清洗(3)增敏(4)清洗(5)染色(6)清洗(7)顯影(8)定影(9)水洗

3.凝膠掃描及圖像分析

(1)圖像掃描：凝膠染色后采用Image scanner以300dpi，16-bit模式（65536灰階）進(jìn)行掃描。

(2)圖像分析：掃描完畢后，凝膠繼續(xù)置于1%yi酸中于4℃保存。掃描后的圖像用ImageMaster 2D Platinum software軟件進(jìn)行分析。分析按照軟件廠商提供的說明書進(jìn)行。microRNA芯片:RNA干擾(RNAInterference,RNAi)現(xiàn)象是一種進(jìn)化上保守的抵御轉(zhuǎn)基因或外來病毒qin犯的防御機(jī)制。以zui小點(diǎn)面積30，平滑度2為主要參數(shù)zui大限度檢測蛋白質(zhì)點(diǎn)。以目標(biāo)蛋白質(zhì)3個(gè)重復(fù)具有相同趨勢，目標(biāo)蛋白質(zhì)相鄰位點(diǎn)的相對一致性，至少2個(gè)重復(fù)有2倍以上差異作為判定差異表達(dá)蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)。

蛋白質(zhì)定量組學(xué)服務(wù)

細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)組豐度的動(dòng)態(tài)變化對不同生命過程有重要影響。例如在許多疾病的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程中，常常伴隨著某些蛋白質(zhì)的表達(dá)異常。microRNA通過和靶基因mRNA堿基配對引導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）降解mRNA或抑制mRNA的翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控蛋白表達(dá)（新發(fā)現(xiàn)miRNA也能在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因表達(dá)）。目前定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)主要分為標(biāo)記(label)策略和非標(biāo)記的(label free)定量策略，其中標(biāo)記策略又分為體內(nèi)標(biāo)記(如 SILAC、15N 標(biāo)記)，以及體外標(biāo)記(如 iTRAQ、TMT 標(biāo)記) 。

傳統(tǒng)的基于2D雙向凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)組通常可以鑒定出約1000種蛋白，對全蛋白質(zhì)組的覆蓋僅在5~10%左右，不能滿足高通量定量蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析的要求。我們結(jié)合樣品制備與高分辨率、高靈敏度的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，可在細(xì)胞與組織類樣品中鑒定直至多于10000個(gè)蛋白，對全蛋白質(zhì)組的覆蓋>60%。實(shí)驗(yàn)流程：細(xì)胞或組織RNA提取-RNA濃度檢測-RNA逆轉(zhuǎn)錄-定量PCR檢測。結(jié)合生物信息學(xué)分析，為您構(gòu)建高通量蛋白質(zhì)定量表達(dá)譜。

通?；钚匝蹶栃詫φ赵诖碳ぜ?xì)胞20-30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。

收集細(xì)胞后裝載探針：按照1：1000用無培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10微摩爾/升。細(xì)胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，細(xì)胞濃度為一百萬至二千萬/毫升，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘。每隔3-5分鐘顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體主要優(yōu)點(diǎn)：轉(zhuǎn)染范圍廣，可以各種細(xì)胞類型，轉(zhuǎn)入的外源基因可完全融合，對細(xì)胞率高，細(xì)胞不產(chǎn)生病變，可建立細(xì)胞系長期持續(xù)表達(dá)外源基因。用無細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。直接用活性氧陽性對照及自己感興趣的刺激細(xì)胞，或把細(xì)胞等分成若干份后刺激細(xì)胞。通?；钚匝蹶栃詫φ赵诖碳ぜ?xì)胞20-30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。

2.、檢測

對于原位裝載探針的樣品可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察，或收集細(xì)胞后用熒光分光光度計(jì)、熒光或流式細(xì)胞儀檢測。

對于收集細(xì)胞后裝載探針的樣品可以用熒光分光光度計(jì)、熒光或流式細(xì)胞儀檢測，用激光共聚焦顯微鏡直接觀察也可以。