三、自噬過程進(jìn)行觀察和檢測

1、觀察自噬體的形成

由于自噬體屬于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，普通光鏡下看不到，因此，直接觀察自噬體需在透射電鏡下。Phagophore的特征為:新月狀或杯狀，雙層或多層膜,有包繞胞漿成分的趨勢。破骨細(xì)胞標(biāo)志基因TRAP在共培養(yǎng)3天時開始表達(dá)，而MMP-9和CathepsinK則在共培養(yǎng)5天后表達(dá)結(jié)論共培養(yǎng)體系中成骨細(xì)胞對破骨細(xì)胞調(diào)控作用顯著誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞具有噬骨能力，該共培養(yǎng)模型可用于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間的相互調(diào)控作用研究。自噬體(AV1 )的特征為:雙層或多層膜的液泡狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)含胞漿成分，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等。自噬溶酶體(AV2 )的特征為:單層膜，胞漿成分己降解。( autophagic vacuolo AV )

2、在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋 白來示蹤自噬形成由于電鏡耗時長，不利于監(jiān)測(Monitoring) 自噬形成，人們利用LC3在自噬形成過程中發(fā)生聚集的現(xiàn)象開發(fā)出了此技術(shù)。(5)把消化所得的軟gu細(xì)胞混懸液收集于離心管中，經(jīng)濾網(wǎng)過濾后用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù),并把細(xì)胞混懸液密度調(diào)整為2x105/ml接種于25cm2規(guī)格的培養(yǎng)瓶中。無自噬時，GFP-LC3融合蛋 白彌散在胞漿中;自噬形成時，GFP-LC3融合蛋白轉(zhuǎn) 位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色熒光斑點(diǎn)，一個斑點(diǎn)相當(dāng)于一個自噬體，可以通過計數(shù)來評價自噬活性的高低。

3、利用Western Blot檢測LC3-II/比值的變化以評價自噬形成自噬形成時，胞漿型LC3 (即 LC3-I)會酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)?自噬體)膜型(即LC3-ID，因此，LC3-II/比值 的大小可估計自噬水平的高低。(注意: LC3對LC3-II有更高的親和力，會造成假陽性。軟gu細(xì)胞培養(yǎng)(1)豚鼠脫頸處死，備皮，用75%酒精消毒背部及四肢皮膚。方法2和3需結(jié)合使用，同時需考慮溶酶體活性的影響。)

4、MDC (Monodansylcadaverine ，單丹磺酰尸胺)染色:包括自噬體，所有酸性液泡都被染色，故屬于非特異性的。

5、CellTrackerTM Green染色:主要用于雙染色，但其能染所有的液泡，故也屬于非特異性的。

細(xì)胞分化

細(xì)胞分化是指同一來源的細(xì)胞逐漸產(chǎn)生出形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能特征各不相同的細(xì)胞類群的過程，其結(jié)果是在空間上細(xì)胞產(chǎn)生差異，在時間上同一細(xì)胞與其從前的狀態(tài)有所不同。細(xì)胞分化的本質(zhì)是基因組在時間和空間上的選擇性表達(dá)，通過不同基因表達(dá)的開啟或關(guān)閉，終產(chǎn)生標(biāo)志性蛋白質(zhì)。相較于直接對進(jìn)行基于蛋白質(zhì)分析的測序相比，得益于基因測序技術(shù)的發(fā)展，雜交瘤測序可以提供更準(zhǔn)確更可靠的結(jié)果，防止蛋白測序中如亮氨酸/異亮氨酸較難區(qū)分等潛在風(fēng)險。細(xì)胞誘導(dǎo)是指將一群不同類型或者形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能特征存在差異的細(xì)胞通過生物學(xué)、物理學(xué)等手段，將之轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂邢嗨?相同形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能特征的細(xì)胞群體的過程。

細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染及解決方法

霉菌污染

正常情況下，培養(yǎng)基在 37℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩三天，在倒置顯微鏡下仍保持透明，無雜質(zhì)。一旦出現(xiàn)絮狀雜質(zhì)，顯微鏡下可見絲狀和團(tuán)塊狀漂浮物，菌絲明顯。此時，雖然細(xì)胞仍在生長，但它們的生命狀態(tài)會在長時間后逐漸惡化。

解決方法：用硫酸銅溶液擦拭 CO2 培養(yǎng)箱，向托盤中加入飽和硫酸銅或消毒后加入飽和磷酸氫二鈉高鹽溶液，避免霉菌污染。

如果霉菌污染，暫時轉(zhuǎn)移所有細(xì)胞，并立即使用 guo 氧擦拭培養(yǎng)箱，包括層板和內(nèi)壁。將 guo 氧放在培養(yǎng)箱中一小時，使蒸汽擴(kuò)散，待 guo 氧氣味消散后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中。目前，已報道的自ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化的細(xì)胞主要包括胰島細(xì)胞、造血細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟gu細(xì)胞和黑素細(xì)胞等。值得注意的是，培養(yǎng)箱需要每兩個月定期清洗一次，尤其是在梅雨季節(jié)。用 84 消毒液、清水和 75% 酒精連續(xù)擦拭培養(yǎng)箱，用紫外線照射也是一種有效的方法。

為防止霉菌污染，需添加 3μg/ml 、抑制素、fang

線菌素 D 或青鏈。25克胰酶蛋白酶(活力為1:250)，加入100ml無Ca2 、Mg2 的Hank's液溶解，濾器過濾chu菌，4°C保存,用前可在379C下回溫。一旦被污染，就不可能恢復(fù)，即使使用上述，也沒有什么區(qū)別。對于支原體污染的細(xì)胞培養(yǎng)，選擇是丟棄污染的培養(yǎng)物，并用使用新鮮的無支原體的儲存液，消毒環(huán)境。如果所有的細(xì)胞都被污染了，那可能是整個培養(yǎng)系統(tǒng)污染了。因此，必須對培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)設(shè)備進(jìn)行檢查。如果只是個別污染，可能是操作問題，有必要注意實(shí)驗(yàn)操作步驟的規(guī)范。