色譜分析法、層析法，是一種分離和分析方法，現(xiàn)代生物企業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中的核心技術(shù)之一。在分析化學(xué)、有機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)等領(lǐng)域有著非常廣泛的應(yīng)用。使用三乙胺作為封尾劑，與硅羥基吸附，可以使峰型改善，這個(gè)三乙胺曾經(jīng)一度成為分析界的寶貝和。色譜法利用不同物質(zhì)在不同相態(tài)的選擇性分配，以流動(dòng)相對(duì)固定相中的混合物進(jìn)行洗脫，混合物中不同的物質(zhì)會(huì)以不同的速度沿固定相移動(dòng)，終達(dá)到分離的效果。色譜理論：保留時(shí)間保留時(shí)間是樣品從進(jìn)入色譜柱到流出色譜柱所需要的時(shí)間，不同的物質(zhì)在不同的色譜柱上以不同的流動(dòng)相洗脫會(huì)有不同的保留時(shí)間，因此保留時(shí)間是色譜分析法比較重要的參數(shù)之一。保留時(shí)間由物質(zhì)在色譜中的分配系數(shù)決定：tR = t0(1 KVs / Vm)式中tR表示某物質(zhì)的保留時(shí)間，t0是色譜系統(tǒng)的死時(shí)間，即流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱到流出色譜柱的時(shí)間，這個(gè)時(shí)間由色譜柱的孔隙、流動(dòng)相的流速等因素決定。K為分配系數(shù)，VsVm表示固定相和流動(dòng)相的體積。這個(gè)公式又叫做色譜過(guò)程方程，是色譜學(xué)基本的公式之一。

制備型加壓液相色譜，按照色譜柱和樣品量的大小，分為：（1）低壓液相色譜；（2）中壓液相色譜；（3）高壓液相色譜；（4）快速色譜。低壓、中壓與高壓液相色譜的壓力范圍之間會(huì)存在一定交疊，沒(méi)有統(tǒng)一、明確的標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)柱子分離過(guò)含有高水分樣品后，需要將色譜柱重新老化，以除去固定相中吸附的水分。 快速色譜柱壓通常為2bar（或30psi）左右，對(duì)于那些容易分離的簡(jiǎn)單混合物，由于快速色譜具有操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，常常是實(shí)驗(yàn)室的佳選。但快速色譜不同于一般的層析分離，這種分離沒(méi)有壓力，而快速分離通常使用瓶裝氮?dú)饧訅?，使流?dòng)相具有一定的流速，從而縮短了分離時(shí)間。 快速色譜使用的柱子一般是玻璃柱，柱直徑為3～10cm．長(zhǎng)度為7～15cm?？焖偕V中使用廣泛的固定相為硅膠。采用的粒徑通常為：25～40μm，40～63μm或63～200μm的球形固定相。其它如鍵合相、氧化鋁、聚酰胺吸附劑也常用作快速色譜的固定相使用。

液相色譜法開(kāi)始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動(dòng)相，稱為經(jīng)典液相色譜法，此方法柱效低、時(shí)間長(zhǎng)(常有幾個(gè)小時(shí))。(3)固定相的選擇硅膠、鍵合固定相(如C18)、離子交換樹(shù)脂、聚酰胺、氧化鋁、凝膠等都可以作為色譜柱的填料。液相色譜法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來(lái)的。也稱現(xiàn)代液相色譜。

HPLC的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)

HPLC有以下特點(diǎn)：

高壓—壓力可達(dá)150~300Kg/cm2。色譜柱每米為75 Kg/cm2以上。

高速—流速為0.1~10.0 ml/min。

—可達(dá)5000塔板每米。在一根柱中同時(shí)分離成份可達(dá)100種。

高靈敏度—紫外檢測(cè)器靈敏度可達(dá)0.01ng。同時(shí)消耗樣品少。