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熒光定量PCR技術(shù)產(chǎn)生并成熟于上世紀(jì)90年代，由于該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，能夠?qū)CR反應(yīng)的全過程進(jìn)行實(shí)時監(jiān)控，并且自動化程度高，所以該技術(shù)從產(chǎn)生到現(xiàn)在短短的十幾年時間，在科研及檢驗(yàn)領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用，成為分子生物學(xué)領(lǐng)域不可或缺的一項(xiàng)重要技術(shù)。在real-timeQ-PCR中，對整個PCR反應(yīng)擴(kuò)增過程進(jìn)行了實(shí)時的監(jiān)測和連續(xù)地分析擴(kuò)增相關(guān)的熒光信號，隨著反應(yīng)時間的進(jìn)行，監(jiān)測到的熒光信號的變化可以繪制成一條曲線。熒光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號隨著PCR反應(yīng)的積累來實(shí)時監(jiān)控PCR反應(yīng)的進(jìn)程，并通過分析軟件對PCR的反應(yīng)進(jìn)行檢測分析的技術(shù)。系統(tǒng)組成：定量PCR儀、電腦、分析軟件、試劑及耗材。

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進(jìn)行熒光定量PCR體系的配制時i好在冰上進(jìn)行，操作環(huán)境不用非得在超凈臺中進(jìn)行，環(huán)境安靜整潔都可以。因?yàn)槊恳粋€梯度要做三個重復(fù)，因此先在1ml的無菌離心管中配制好后再分裝入96孔板中。研究表明熱工過程可以殺滅病毒（如流行性腹瀉病毒），但這只能作為緊急緩解措施，因?yàn)檫@要求產(chǎn)品在干燥和運(yùn)輸過程中必須不存在交叉污染。實(shí)驗(yàn)中我使用過熒光定量八聯(lián)管和96孔板，個人推薦96孔板。因?yàn)榘寺?lián)管你需要蓋上蓋子，而且蓋子比較的難按下去，稍不慎就把八聯(lián)管弄斷或者液體撒出來。有的時候一下忘記了是從哪邊開始的。96孔板比較方便，加完樣品后只需附上一層膜，用它自帶的板子撫平即可。上機(jī)器前i好離心一下，讓貼在管壁上的液體流下來同時也消掉氣泡。

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QF-PCR技術(shù)在國外已有較廣泛的應(yīng)用，但目前尚未在國內(nèi)產(chǎn)前診斷臨床中普遍開展。豬場一線需要快速檢測技術(shù)以盡早確診，做到早處理、早隔離，但要明確的是，豬場只需要通過合適的檢測工具，幫助“定性”即可，不需要深入定量分析，有問題直接捕殺無害化處理。為規(guī)范使用QF-PCR技術(shù)，由國家衛(wèi)生和計劃生育委i員會召集、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心主辦的"全國產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)管理規(guī)范編制研討會"于2015年11月14日在成都召開，會議就QF-PCR等快速產(chǎn)前診斷技術(shù)的臨床應(yīng)用進(jìn)展及其在國內(nèi)應(yīng)用中存在的具體問題進(jìn)行了深入而廣泛的探討，并形成了QF-PCR技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用共識。

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熒光定量PCR早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。主要是利用磁珠純化核酸及蛋白質(zhì)從而達(dá)到提取核酸的目的，在細(xì)胞、動植物組織等研究方面，一個樣品用一個探針，有效防止樣品之間的交叉污染。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理： 隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強(qiáng)度信號，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測 產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。 

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定量PCR已經(jīng)從基于凝膠的低通量分析發(fā)展到高通量的熒光分析技術(shù)，即實(shí)時定量PCR。因?yàn)榘寺?lián)管你需要蓋上蓋子，而且蓋子比較的難按下去，稍不慎就把八聯(lián)管弄斷或者液體撒出來。實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點(diǎn)。實(shí)時定量PCR (real-time quantitative PCR)是指在PCR指數(shù)擴(kuò)增期間通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號強(qiáng)弱的變化來即時測定特異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量，不需要取出PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離。

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PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。96孔板比較方便，加完樣品后只需附上一層膜，用它自帶的板子撫平即可。探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步.