拉曼光譜在生物學(xué)研究中的應(yīng)用    

拉曼光譜是研究生物大分子的有力手段，由于水的拉曼光譜很弱、譜圖又很簡(jiǎn)單，故拉曼光譜可以在接近自然狀態(tài)、活性狀態(tài)下來研究生物大分子的結(jié)構(gòu)及其變化。

生物大分子的拉曼光譜可以同時(shí)得到許多寶貴的信息：

（1）蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)：α-螺旋、β-折疊、無規(guī)卷曲及β-回轉(zhuǎn)

（2）蛋白質(zhì)主鏈構(gòu)像：酰胺Ⅰ、Ⅲ，C-C、C-N伸縮振動(dòng)

（3）蛋白質(zhì)側(cè)鏈構(gòu)像：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的側(cè)鏈和后二者的構(gòu)像及存在形式隨其微環(huán)境的變化

（4）對(duì)構(gòu)像變化敏感的羧基、巰基、S-S、C-S構(gòu)像變化

（5）生物膜的脂肪酸碳?xì)滏溞D(zhuǎn)異構(gòu)現(xiàn)象。

（6）DNA分子結(jié)構(gòu)以及和DNA與其他分子間的作用。

（7）研究脂類和生物膜的相互作用、結(jié)構(gòu)、組分等。

（8）對(duì)生物膜中蛋白質(zhì)與脂質(zhì)相互作用提供重要信息。

先了解一下激光拉曼光譜

拉曼光譜法是研究化合物分子受光照射后所產(chǎn)生的散射，散射光與入射光能級(jí)差和化合物振動(dòng)頻率、轉(zhuǎn)動(dòng)頻率的關(guān)系的分析方法。

與紅外光譜類似，拉曼光譜是一種振動(dòng)光譜技術(shù)。所不同的是，前者與分子振動(dòng)時(shí)偶極矩變化相關(guān)，而拉曼效應(yīng)則是分子極化率改變的結(jié)果，被測(cè)量的是非彈性的散射輻。

一定波長(zhǎng)的電磁波作用于被研究物質(zhì)的分子，引起分子相應(yīng)能級(jí)的躍遷，產(chǎn)生分子吸收光譜。引起分子電子能級(jí)躍遷的光譜稱電子吸收光譜，其波長(zhǎng)位于紫外～可見光區(qū)，故稱紫外－可見光譜。

電子能級(jí)躍遷的同時(shí)伴有振動(dòng)能級(jí)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)的躍遷。引起分子振動(dòng)能級(jí)躍遷的光譜稱振動(dòng)光譜，振動(dòng)能級(jí)躍遷的同時(shí)伴有轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)的躍遷。拉曼散射光譜是分子的振動(dòng)－轉(zhuǎn)動(dòng)光譜。用遠(yuǎn)紅外光波照射分子時(shí)，只會(huì)引起分子中轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)的躍遷，得到純轉(zhuǎn)動(dòng)光譜。

拉曼光譜的優(yōu)點(diǎn)在于它的快速，準(zhǔn)確，測(cè)量時(shí)通常不破壞樣品（固體，半固體，液體或氣體），樣品制備簡(jiǎn)單甚至不需樣品制備。譜帶信號(hào)通常處在可見或近紅外光范圍，可以有效地和光纖聯(lián)用。

這也意味著譜帶信號(hào)可以從包封在任何對(duì)激光透明的介質(zhì)，如玻璃，塑料內(nèi)，或?qū)悠啡苡谒蝎@得?，F(xiàn)代拉曼光譜儀使用簡(jiǎn)單，分析速度快（幾秒到幾分鐘），性能很可靠。因此，拉曼光譜與其他分析技術(shù)聯(lián)用比其他光譜聯(lián)用技術(shù)從某種意義上說更加簡(jiǎn)便（可以使用單變量和多變量方法以及校準(zhǔn)。

為什么拉曼光譜儀器不工作？

檢查儀器和所有附件插座都插好并接通電源。

保證激光器（如果附帶電源）都插好并接通，由于激光器有不同種類，可參照每個(gè)激光器的說明書獲取進(jìn)一步的幫助。

在有兩個(gè)或多個(gè)激光器的系統(tǒng)中，確保聯(lián)鎖系統(tǒng)設(shè)置在正確的位置上，正確的激光器被接通。

檢查儀器的外罩處于安全的關(guān)閉狀態(tài)，聯(lián)鎖裝置正在運(yùn)轉(zhuǎn)。

如果以上操作都已經(jīng)檢查過，你就可以準(zhǔn)備進(jìn)行光譜測(cè)試了。將樣品放置在顯微鏡下，啟動(dòng)光譜操作軟件，如果你仍不能得到光譜，檢查下面各項(xiàng)。

保證樣品被正確地放置在顯微鏡下，即樣品被準(zhǔn)確地聚焦并照射在樣品正確的位置上。測(cè)量時(shí)經(jīng)常需改變不同的測(cè)試區(qū)域以避免因樣品不純帶來一些非期望結(jié)果的可能。

保證激光正確輻照在樣品上，保證顯微鏡光圈的孔徑設(shè)置正確并處于正確的位置上（不同品牌的拉曼光譜儀按各自的要求處理）。

檢查所有軟件窗口的設(shè)置是否正確。

檢查成像區(qū)域設(shè)置窗口的數(shù)值并保證激光像點(diǎn)處于該區(qū)域的中心。標(biāo)準(zhǔn)成像區(qū)域應(yīng)該是激光像點(diǎn)中心垂直方向兩邊各10個(gè)像元。檢查狹縫的設(shè)置，當(dāng)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)操作時(shí)，狹縫應(yīng)為50μm。

如果CCD探測(cè)器飽和了，你將得不到任何有用的信息?？刹捎媒档图ぐl(fā)光功率或提高儀器的共焦程度來避免。

當(dāng)檢查完上述各項(xiàng)后，你應(yīng)該可以得到一張樣品的拉曼譜圖。如你仍然不能得到譜圖，可先嘗試測(cè)試單晶硅的拉曼譜。單晶硅是良好的拉曼散射體，可以用來幫助驗(yàn)證儀器的性能。如果用單晶硅樣品可以獲取硅的520cm-1峰，再嘗試測(cè)試樣品?，F(xiàn)在你可以得到樣品的拉曼信號(hào)，但可能噪聲較大。在這種情況下，可參照Q4的建議來提高信噪比和信背比。