細(xì)胞實(shí)驗(yàn)介紹——流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期：

細(xì)胞周期：指細(xì)胞從前一次分裂結(jié)束起到下一次分裂結(jié)束為止的活動(dòng)過(guò)程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期組成。G0/G1期：有絲分裂發(fā)生，細(xì)胞分裂成兩個(gè)細(xì)胞，進(jìn)入下一個(gè)細(xì)胞周期，或者進(jìn)入靜止期（G0期），而G0期從DNA含量上無(wú)法與G1期區(qū)分，細(xì)胞開始RNA和蛋白質(zhì)的合成，但DNA含量仍保持二倍體。(5)把消化所得的軟gu細(xì)胞混懸液收集于離心管中，經(jīng)濾網(wǎng)過(guò)濾后用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),并把細(xì)胞混懸液密度調(diào)整為2x105/ml接種于25cm2規(guī)格的培養(yǎng)瓶中。S期：DNA開始合成，細(xì)胞核內(nèi)DNA的含量介于G1期和G2期之間。G2期和M期：當(dāng)DNA成為4倍體時(shí)，細(xì)胞進(jìn)入G2期。G2期細(xì)胞繼續(xù)合成RNA及蛋白質(zhì)，直到進(jìn)入M期。

PI法是經(jīng)典的周期檢測(cè)方法。結(jié)果:約24小時(shí)組織塊邊緣有游離的新生細(xì)胞長(zhǎng)出,7天即融合成片。PI為插入性核酸熒光染料，能選擇性的嵌入核酸DNA和RNA雙鏈螺旋的堿基之間與之結(jié)合，其結(jié)合的量與DNA的含量成正比例關(guān)系，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，就可以得到細(xì)胞周期各個(gè)階段的DNA分布狀態(tài)，從而計(jì)算出各個(gè)期的百分含量。

一般流程：細(xì)胞收集-70%酒精固定過(guò)夜-PI染色-流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

細(xì)胞凋亡：細(xì)胞凋亡的早期就有細(xì)胞膜表面破損發(fā)生。破損時(shí)凋亡細(xì)胞表面的磷脂腺絲氨酸(PS)可以從細(xì)胞內(nèi)膜翻轉(zhuǎn)至細(xì)胞的外膜。(6)用含15%胎牛xue清及青鏈mei素的DMEM/F12以106/mL的細(xì)胞濃度接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，置37°C、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。該過(guò)程發(fā)生在之前，檢測(cè)PS的表達(dá)，能反映早期凋亡。AnnexinV是Ca2 依賴的磷脂結(jié)合蛋白，對(duì)PS有很高的親和性，并且可以與暴露于細(xì)胞外的PS相結(jié)合。利用這一原理，可以將AnnexinV標(biāo)記熒光來(lái)識(shí)別早期的細(xì)胞凋亡。通常利用AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)來(lái)區(qū)分凋亡和壞死細(xì)胞。PI的膜通透性很差，因而只能標(biāo)記壞死的細(xì)胞。

一般流程：細(xì)胞收集-PI-AnnexinV標(biāo)記-流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

結(jié)果示例：

                                   圖 A 細(xì)胞周期檢測(cè)圖；B 細(xì)胞凋亡檢測(cè)圖

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)介紹——細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)：

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)是體外模擬細(xì)胞遷移能力和修復(fù)能力快捷的檢測(cè)方法。在長(zhǎng)滿的細(xì)胞培養(yǎng)板或者培養(yǎng)皿中，沿著中線使用移液器槍頭或者其他硬物劃1-3條平行的直線，去除中線的細(xì)胞，細(xì)胞在0h、12h、24h后，觀察細(xì)胞往中線遷移情況，判斷細(xì)胞遷移能力。

一般流程：細(xì)胞接種培養(yǎng)-劃痕-不同時(shí)間點(diǎn)拍照

細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)是體外模擬細(xì)胞遷移和侵襲能力的檢測(cè)方法。使用不同孔徑的聚碳酸酯膜transwell小室放入培養(yǎng)板中，將細(xì)胞接種于小室中，利用培養(yǎng)液成分的差異誘導(dǎo)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力的差異。

一般流程：transwell小室準(zhǔn)備-細(xì)胞接種-細(xì)胞培養(yǎng)-transwell小室染色-顯微鏡拍照

                                       圖 A 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)圖；B，C 細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)圖

 細(xì)胞ELISPOT檢測(cè)    

     1．培養(yǎng)板的預(yù)處理：在24孔培養(yǎng)板內(nèi)加0.5ml 0.2%戊er醛，37℃，4h，棄掉板中的處理液，用PBS洗滌3次，每次3min；

     2．抗原包被：將適量抗原溶于包被緩沖液中，每孔加入0.5ml，4℃過(guò)夜，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     3．制備細(xì)胞懸液：將待測(cè)已致敏小鼠處死，取出pi臟，置于加有Hanks液的平皿內(nèi)，用鈍頭直角9號(hào)zhu射器針頭破少許脾被膜后，趕出細(xì)胞，用毛細(xì)吸管輕輕吹散細(xì)胞團(tuán)后，將懸液通過(guò)250目尼龍網(wǎng)，取濾液，1000r/min離心5min，Hanks液洗滌3次，計(jì)數(shù)細(xì)胞后，用1640液重新懸浮細(xì)胞，配成所需濃度；細(xì)胞接種：收到客戶細(xì)胞后，我們會(huì)用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞，得出細(xì)胞懸液濃度。

     4．往各孔中加入0.5ml含不同濃度（104-106/ml）的細(xì)胞懸液，置37℃，5％CO2條件下孵育2-4h，棄掉培養(yǎng)液，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     5．往各孔中加入0.5ml生物素化抗ti（Bio-Ab）（2μg/ml），37℃孵育1h或4℃過(guò)夜，棄掉液體，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     6．加入辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的親合素（Avi-HRP）（2μg/ml），37℃孵育30min，棄掉液體，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     7．配制明膠-底物液：在37℃水浴中，將2.5mlTMB溶液（4mg/ml  jia醇溶液）滴加入7.5ml10%明膠溶液（用pH5.0磷酸鈉-檸檬酸緩沖液配制）邊加邊攪，溶液呈白色，加入14μl 3% H202；

     8．顯色與計(jì)數(shù)：將培養(yǎng)板底冰浴，每孔加入0.6ml明膠-底物液，約3min，混合液凝固，將培養(yǎng)板取出，置室溫5min，將板倒置，用肉眼和低倍放大鏡計(jì)數(shù)所顯示出的顏色的斑點(diǎn)。

流式細(xì)胞分選

流式細(xì)胞分選技術(shù)是利用流式細(xì)胞分選儀，以高能量激光照射高速流動(dòng)狀態(tài)下被熒光色素染色的單細(xì)胞或微粒,測(cè)量其產(chǎn)生的散射光和發(fā)射熒光的強(qiáng)度,從而對(duì)細(xì)胞(或微粒)的物理、生理、生化、免yi、遺傳、分子生物學(xué)性狀及功能狀態(tài)等進(jìn)行定性或定量檢測(cè)的--種現(xiàn)代細(xì)胞分析技術(shù)，它可根據(jù)發(fā)射光的熒光強(qiáng)度和波長(zhǎng)將發(fā)光顆粒亞群分開并可實(shí)現(xiàn)單ke隆分選，能復(fù)雜樣本中的細(xì)胞進(jìn)行鑒定、分類、定量和分離,單次可同時(shí)對(duì)其中一種到四種特定細(xì)胞進(jìn)行超高速分選純化、高通量單分選或細(xì)胞芯片制備。CD117(c-kit)陽(yáng)性細(xì)胞和二者都陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比前后比較差異無(wú)顯著性(P>。分選后的細(xì)胞能直接用于培養(yǎng)、移植、核酸提取、單細(xì)胞PCR擴(kuò)增或原位雜交等，可進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞基因、蛋白、功能水平的研究和不同細(xì)胞之間的差異化研究。硬件中樣本細(xì)胞丟棄的比例低于5%，保證樣本中目標(biāo)細(xì)胞的高回收率。