大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)

方法：分離大鼠主動(dòng)脈,直接貼壁于培養(yǎng)皿中,熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),免yi組化Ⅷ因子相關(guān)抗原染色鑒定細(xì)胞.結(jié)果:約24小時(shí)組織塊邊緣有游離的 新生細(xì)胞長(zhǎng)出,7天即融合成片.消化傳代后細(xì)胞呈短梭形或三角形,單層生長(zhǎng),鋪路石狀,Ⅷ因子表達(dá)陽性,呈指數(shù)增殖.凍存后復(fù)蘇細(xì)胞活性均超過90%.結(jié) 論:用貼壁法成功建立了大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)方法,凍存細(xì)胞存活率高,為體外研究提供了穩(wěn)定的模型.

成纖維細(xì)胞分離方法

1.處死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超凈臺(tái)中用剪刀和鑷子將孕鼠皮膚剪開，用另外- -組剪刀、鑷子剪開腹部肌層，露出，后用第三組剪刀和鑷子將小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，沖洗去血。

2.用兩把彎鑷子將胚胎外的胞膜小心去除，然后夾掉頭和內(nèi)臟，將其余胚胎轉(zhuǎn)移到一個(gè)裝有30 ml D-PBS的50 ml離心管中，輕輕顛倒兩次，倒掉D-PBS,再重復(fù)此步驟一次，注意要留少許D-PBS，然后將胚胎轉(zhuǎn)移到另- -裝有D-PBS的平皿中，并用手術(shù)刀片將其細(xì)細(xì)切碎。(3)PBS緩沖液充分漂洗軟gu小塊3次，然后用小剪刀將軟gu塊切碎至約Imm3大小。

3. 用200 μ的移液槍反復(fù)、快速地吹打平皿中的液體，轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中，于4C 1500 rpm離心5分鐘，倒掉上清，以10 ml胰酶重懸沉淀，放在37C水浴中消化30分鐘，且每隔五分鐘輕輕晃動(dòng)，使之充分消化。

4.將上層細(xì)胞懸液倒入一個(gè)裝有10 ml MEF生長(zhǎng)培養(yǎng)基的50 ml離心管中，用200目的尼龍網(wǎng)過濾后，以1500 rpm離心5分鐘收集細(xì)胞，再用30 ml MEF生長(zhǎng)培養(yǎng)基洗滌兩次。

5.細(xì)胞沉淀用15 ml MEF生長(zhǎng)培養(yǎng)基重懸后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)(- -般8只14天的胎鼠可獲得2-3x107細(xì)胞)。

6. 3x106細(xì)胞懸浮于15 ml MEF生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，接種到200 ml培養(yǎng)瓶中。

7. 24小時(shí)后更換新鮮的MEF生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

8.細(xì)胞長(zhǎng)滿后，先用D-PBS沖洗，倒掉后加胰酶消化(此步時(shí)間不宜過長(zhǎng)，作者- -般不超過五分鐘)，按1:5傳代。

9. 細(xì)胞再次長(zhǎng)到覆蓋率80-90%左右， 將其消化后，常規(guī)凍存(凍存液要現(xiàn)配)。

細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染及解決方法

黑點(diǎn)污染

黑色的游動(dòng)點(diǎn)能穿透濾膜并在空氣中擴(kuò)散。它們?cè)诘捅剁R下顯示為黑色圓點(diǎn)，在高倍鏡下顯示為可移動(dòng)的黑點(diǎn)。4ml溫室凝固，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，胰酶消化后吹散成單個(gè)細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，并調(diào)細(xì)胞濃度為10000個(gè)/ml，將0。培養(yǎng)液也不渾濁，一般影響較小，因此細(xì)胞仍可使用。通常，黑點(diǎn)污染后，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，運(yùn)動(dòng)物體無明顯增加，培養(yǎng)基的顏色和透明度無明顯變化。在同一批培養(yǎng)的細(xì)胞中也可以發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象。

解決方法：黑點(diǎn)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)沒有明顯影響，細(xì)胞增殖后會(huì)自然消失，因此除了置換外，無需特殊處理。如果細(xì)胞可能被小的運(yùn)動(dòng)點(diǎn)污染，建議增加培養(yǎng)皿細(xì)胞密度，以提高細(xì)胞存活率。