大鼠主動脈內(nèi)皮細胞的分離培養(yǎng)

方法：分離大鼠主動脈,直接貼壁于培養(yǎng)皿中,熒光倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài),免yi組化Ⅷ因子相關(guān)抗原染色鑒定細胞.結(jié)果:約24小時組織塊邊緣有游離的 新生細胞長出,7天即融合成片.消化傳代后細胞呈短梭形或三角形,單層生長,鋪路石狀,Ⅷ因子表達陽性,呈指數(shù)增殖.凍存后復(fù)蘇細胞活性均超過90%.結(jié) 論:用貼壁法成功建立了大鼠血管內(nèi)皮細胞體外培養(yǎng)方法,凍存細胞存活率高,為體外研究提供了穩(wěn)定的模型.

成纖維細胞分離方法

1.處死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超凈臺中用剪刀和鑷子將孕鼠皮膚剪開，用另外- -組剪刀、鑷子剪開腹部肌層，露出，后用第三組剪刀和鑷子將小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，沖洗去血。

2.用兩把彎鑷子將胚胎外的胞膜小心去除，然后夾掉頭和內(nèi)臟，將其余胚胎轉(zhuǎn)移到一個裝有30 ml D-PBS的50 ml離心管中，輕輕顛倒兩次，倒掉D-PBS,再重復(fù)此步驟一次，注意要留少許D-PBS，然后將胚胎轉(zhuǎn)移到另- -裝有D-PBS的平皿中，并用手術(shù)刀片將其細細切碎。(3)PBS緩沖液充分漂洗軟gu小塊3次，然后用小剪刀將軟gu塊切碎至約Imm3大小。

3. 用200 μ的移液槍反復(fù)、快速地吹打平皿中的液體，轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中，于4C 1500 rpm離心5分鐘，倒掉上清，以10 ml胰酶重懸沉淀，放在37C水浴中消化30分鐘，且每隔五分鐘輕輕晃動，使之充分消化。

4.將上層細胞懸液倒入一個裝有10 ml MEF生長培養(yǎng)基的50 ml離心管中，用200目的尼龍網(wǎng)過濾后，以1500 rpm離心5分鐘收集細胞，再用30 ml MEF生長培養(yǎng)基洗滌兩次。

5.細胞沉淀用15 ml MEF生長培養(yǎng)基重懸后進行細胞計數(shù)(- -般8只14天的胎鼠可獲得2-3x107細胞)。

6. 3x106細胞懸浮于15 ml MEF生長培養(yǎng)基中，接種到200 ml培養(yǎng)瓶中。

7. 24小時后更換新鮮的MEF生長培養(yǎng)基。

8.細胞長滿后，先用D-PBS沖洗，倒掉后加胰酶消化(此步時間不宜過長，作者- -般不超過五分鐘)，按1:5傳代。

9. 細胞再次長到覆蓋率80-90%左右， 將其消化后，常規(guī)凍存(凍存液要現(xiàn)配)。

細胞培養(yǎng)中常見的污染及解決方法

黑點污染

黑色的游動點能穿透濾膜并在空氣中擴散。它們在低倍鏡下顯示為黑色圓點，在高倍鏡下顯示為可移動的黑點。4ml溫室凝固，取對數(shù)期細胞，胰酶消化后吹散成單個細胞懸液，計數(shù)，并調(diào)細胞濃度為10000個/ml，將0。培養(yǎng)液也不渾濁，一般影響較小，因此細胞仍可使用。通常，黑點污染后，細胞生長良好，運動物體無明顯增加，培養(yǎng)基的顏色和透明度無明顯變化。在同一批培養(yǎng)的細胞中也可以發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象。

解決方法：黑點對細胞生長狀態(tài)沒有明顯影響，細胞增殖后會自然消失，因此除了置換外，無需特殊處理。如果細胞可能被小的運動點污染，建議增加培養(yǎng)皿細胞密度，以提高細胞存活率。