陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照的體外GTPγS/ GDP蛋白質(zhì)上樣量

注意：體內(nèi)細(xì)胞刺激將激l活可用Arf 6的大約10％，而體外GTPγS蛋白負(fù)載將激l活A(yù)rf 6的將近90％。

1，將0.5 ml每種細(xì)胞提取物等分到兩個(gè)微量離心管中（或使用1 μg純化的Arf 6蛋白）。

2，向每個(gè)試管中加入20 μl 0.5 M EDTA（終濃度為20 mM）。

3，將5 μl 100 XGTPγS（至100 μM，終濃度）加到一個(gè)試管中（陽(yáng)性對(duì)照）。

4，在第二個(gè)試管中加入5 μl 100 X GDP（至1 mM，終濃度）（陰性對(duì)照）。

5，在攪拌下將試管在30°C孵育30分鐘。

6，通過(guò)將試管放在冰上并添加32.5 μl 1 M MgCl2（至60 mM，終濃度）來(lái)停止加載。

免l疫印跡和檢測(cè)（所有步驟均在室溫下攪拌）

1.在電印跡步驟之后，將PVDF膜浸入100％甲l醇中15秒鐘，然后使其在室溫下干燥5分鐘。注意：如果使用硝l酸纖維素代替PVDF，則應(yīng)跳過(guò)此步驟。

2.在室溫下不斷攪拌下，在TBST中用5％脫脂奶粉或3％BSA封閉膜1小時(shí)。

將膜與抗Arf 6兔多克l隆抗l體在5％脫脂奶粉或3％BSA / TBST中以1：50?1000（取決于樣品中Arf 6蛋白質(zhì)的量）新鮮稀釋，孵育1-在室溫下持續(xù)攪拌2小時(shí)或過(guò)夜4oC。

3.用TBST將印跡的膜清洗3次，每次5分鐘。

4.將膜與二抗（例如山羊抗兔IgG，HRP偶聯(lián)物）一起孵育，在室溫下以恒定的比例在5％脫脂奶粉或3％BSA / TBST中以1：1000的比例新鮮稀釋。攪動(dòng)。

5.用TBST將印跡的膜清洗3次，每次5分鐘。

6.使用您選擇的檢測(cè)方法，例如ECL。

當(dāng)前沒(méi)有直接測(cè)定法來(lái)測(cè)量Arl1 GTPases的激l活。

NewEast Biosciences Arl1激l活檢測(cè)試劑盒基于特定于配置的單克l隆抗l體，該抗l體特異性識(shí)別Arl1-GTP，但不能識(shí)別Arl1-GDP。 鑒于單克l隆抗l體對(duì)其抗原的高度親和力，可以在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行激l活測(cè)定。 該測(cè)定法可提供可靠的結(jié)果，并具有一致的可重復(fù)性。

紐斯特生物技術(shù)有限公司推出的Cdc42活性檢測(cè)試劑盒主要是依據(jù)單克l隆抗l體能夠特異性的識(shí)別Cdc42-GTP結(jié)合蛋白，而不識(shí)別Cdc42-GDP結(jié)合蛋白，進(jìn)而簡(jiǎn)單并且快速的進(jìn)行Cdc42的活性檢測(cè)。同時(shí)試劑盒中的Cdc42-GTP單克l隆抗l體也可以進(jìn)行免l疫組化實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞和組織中Cdc42的活性監(jiān)測(cè)。每套試劑盒可以進(jìn)行20次檢測(cè)。