在選用支原體PCR法檢測(cè)來(lái)替代藥典方法時(shí)，需要考慮如下兩個(gè)方面：

首先一步是要使用符合歐洲藥典要求，經(jīng)過(guò)全方面驗(yàn)證的支原體檢測(cè)試劑盒，第二部是自我驗(yàn)證，即確認(rèn)所用的樣本基質(zhì)對(duì)于該試劑盒方法是合適的，并且操作過(guò)程是正確的。小規(guī)模的室內(nèi)驗(yàn)證通常需要采用三個(gè)不同批次的試劑盒，然后加入10CFU的標(biāo)準(zhǔn)品，做復(fù)孔（通常是8個(gè)復(fù)孔），并且至少選擇3個(gè)支原體物種進(jìn)行驗(yàn)證。

有的支原體標(biāo)準(zhǔn)品廠家會(huì)提供CFU與基因拷貝數(shù)的比值，以方便二者的換算。因?yàn)?0CFU只能確定PCR能夠達(dá)到的檢測(cè)限在10CFU以下，但無(wú)法具體確定靈敏度的數(shù)值。帶DNA拷貝數(shù)標(biāo)定的基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品則可進(jìn)一步確定檢測(cè)限的數(shù)值。

總之，PCR方法很有用，但需要避免假陰性，驗(yàn)證時(shí)應(yīng)使用陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、無(wú)模板對(duì)照和內(nèi)控對(duì)照，以保證PCR反應(yīng)正常，以及支原體少量存在時(shí)確實(shí)能檢出來(lái)，支原體不存在時(shí)也確保是結(jié)果陰性，從而使得PCR方法在工業(yè)應(yīng)用時(shí)能確保zui終結(jié)果的可靠。

植物ＤＮＡ的ＳＤＳ提取法：1 取2-3ｇ新鮮葉片,在液氮中研磨成粉狀(防止溶化)后轉(zhuǎn)入15ｍｌ離心管中。2 加入5ｍｌ于65℃預(yù)熱的提取緩沖液,65℃水浴保溫30ｍｉｎ(搖動(dòng)數(shù)次),使提取液與樣品充分混合。3 加入2ｍｌ5ｍｏｌ/ＬＫＡｃ,劇烈振蕩,冰浴保溫20ｍｉｎ以上。4 2700×ｇ離心20ｍｉｎ,將上清液倒入新的15ｍｌ離心管中,(若提?。模危劣糜冢樱铮酰簦瑁澹颍畹葘?shí)驗(yàn),一般在轉(zhuǎn)移上清時(shí)加濾膜,防止樣品殘?jiān)烊?可保證ＤＮＡ純度)。5 加入4ｍｌ氯1仿/異戊1醇(24∶1),搖勻,平衡,2700×ｇ離心15ｍｉｎ。6 在另一新的15ｍｌ離心管中加入5ｍｌ預(yù)冷的異丙1醇,將上清液用移液槍轉(zhuǎn)入此管,在-20℃冷卻30ｍｉｎ以上。7 2700×ｇ離心10ｍｉｎ,棄去上清液,用4ｍｌ70%乙醇洗滌,室溫保持10ｍｉｎ。2700×ｇ離心3ｍｉｎ,倒去上清液。8 重復(fù)步驟7,用4ｍｌ70%乙醇洗滌,室溫保持10ｍｉｎ。2700×ｇ離心3ｍｉｎ,倒去上清液。超凈工作臺(tái)內(nèi)吹干(3ｈ左右)。9 加1ｍｌＴＥ緩沖液中溶解,加10μｌＲＮａｓｅ(10ｍｇ/ｍｌ),在37℃恒溫箱中溫育20ｍｉｎ。10 再加100μｌ3ｍｏｌ/ＬＮａＡｃ和2ｍｌ無(wú)水乙醇,2700×ｇ離心3ｍｉｎ,倒去上清液。超凈工作臺(tái)內(nèi)吹干(3ｈ左右)。11 將ＤＮＡ沉淀溶于150μｌＴＥ中,置于超凈工作臺(tái)內(nèi)(3ｈ左右)。將ＴＥ溶液轉(zhuǎn)入已滅菌的1 5ｍｌｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中,-20℃保存?zhèn)溆谩?

棉花等酚類、多糖類物質(zhì)較多的植物ＤＮＡ提取法：

1 取2ｇ新鮮幼嫩的葉片放入研缽中,加入液氮后快速、充分研磨,待成極細(xì)的粉末狀時(shí)迅速轉(zhuǎn)入到50ｍｌ離心管中。

2 在50ｍｌ離心管中加入10ｍｌ冰預(yù)冷的提取緩沖液,在渦懸振蕩器上充分混勻。

3 于4℃,2700×ｇ離心20分鐘,倒去上清液。

4 在沉淀中加入5ｍｌ裂解緩沖液,在渦旋振蕩器上充分混勻。

5 于65℃水浴鍋中溫育30ｍｉｎ。

6 加入5ｍｌ氯1仿/異戊1醇(24/1),并上下翻轉(zhuǎn)以充分混合。

7 于4℃,2700×ｇ離心5分鐘。

8 轉(zhuǎn)移上層水相至一新的50ｍｌ離心管中。

9 重復(fù)步驟7-9一次。

10 加入2/3體積的冰預(yù)冷的異丙1醇,并上下翻轉(zhuǎn)以充分混合,至-20℃2ｈ。

11 于4℃,1200×ｇ離心10ｍｉｎ。

12 在一新管中加入20ｍｌ含80%乙醇15ｍｍｏｌ/ＬＮａＡｃ溶液,用玻棒將ＤＮＡ轉(zhuǎn)入該管(如不能直接用玻棒纏出,可離心后倒出上清,再在其中加入20ｍｌ含80%乙醇15ｍｍｏｌ/ＬＮａＡｃ溶液),放置20ｍｉｎ后稍許離心,移走上清并吸出殘存乙醇,室溫干燥。

13 加入1 0ｍｌＴＥ(10ｍｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ-ＨＣｌＰＨ=8 0,1ｍｍｏｌ/ＬＥＤＴＡ)并加入終濃度為20(ｇ/Ｌ的ＲＮａｓｅＡ,過(guò)夜。

14 風(fēng)干,用50μｌＴＥ緩沖液溶解,存于-20℃?zhèn)溆谩?br />

鼻咽拭子的采集

被采集人員需要 保持頭部不動(dòng)，采樣人員去除鼻腔內(nèi)壁的分泌物。然后采樣人員一手輕扶被采集人員頭部，一手將鼻咽拭子緩緩插入鼻腔至鼻咽部。在鼻咽部，拭子將停留數(shù)秒吸取分泌物，而后采樣人員輕輕旋轉(zhuǎn)取出拭子，將樣本保存并送檢。

咽拭子的采集

被采集人員先用 生理鹽水漱口，采樣人員將拭子放入無(wú)菌生理鹽水中濕潤(rùn)。被采集人員頭部微仰并保持不動(dòng)，嘴張大，并發(fā)“啊”音，露出兩側(cè)咽扁桃體，采集人員將拭子越過(guò)舌根，在被采集者兩側(cè)咽扁桃體稍微用力來(lái)回擦拭至少3次，然后再在咽后壁上下擦拭至少3次。

需要注意的是，兩種采集方法， 被采集人員均會(huì)稍感不適，所以在采樣的過(guò)程中，被采集人員需稍稍克服一下不適感， 配合采樣人員的工作。不可過(guò)度活動(dòng)頭部，以免拭子劃傷粘膜。如被采集人員發(fā)生刺激性咳嗽，采集過(guò)程需稍作暫停。