原位雜交中探針的選擇

DNA探針、RNA探針和寡核苷酸探針均能通過不同的酶促分子反應(yīng)進行標(biāo)記。寡核苷酸探針的長度較短，因此避免了探針內(nèi)部退火的問題，在雜交時的滲透能力也更好，探針與靶標(biāo)的接觸這是影響原位雜交是否成功的重要因素之一。DNA探針、RNA探針在合成時需要控制探針片段長度，通常300-1000bp左右，能覆蓋到較長片段的靶核酸序列，增加檢測的靈敏度。

雜交流程

雜交液的成分主要影響了核酸雜交的復(fù)性動力學(xué)和熱穩(wěn)定性。雜交液的基礎(chǔ)成分為：Denhardt’s溶液（Ficoll，BSA，PVP），異源核酸（如鯡精3子DNA/tRNA/競爭DNA），磷酸鈉，EDTA，SDS，鹽離子，甲酰胺和硫酸葡聚糖，以及雜交探針。不同的應(yīng)用中進行雜交溫度、pH、鹽離子、甲酰胺、探針濃度等條件的優(yōu)化。常用的pH范圍為6.5~7.5，較高的pH值有助于提高雜交的嚴(yán)謹(jǐn)性。

原位雜交組織（或細(xì)胞）化學(xué)技術(shù)簡稱原位雜交（In situ hybridization, ISH）是應(yīng)用已知堿基順序并帶有標(biāo)記物的核酸探針與組織細(xì)胞內(nèi)待測的核酸，按堿基互補配對原則進行特異性結(jié)合，形成雜交體，然后用與標(biāo)記物相應(yīng)的檢測系統(tǒng)，通過組織化學(xué)或免3疫組織化學(xué)方法在核酸原有位置進行細(xì)胞內(nèi)定位、定性和定量研究。為分子水平研究細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)及有關(guān)細(xì)胞5因子的調(diào)控提供了有效的工具?？梢暈榻M織化學(xué)與免3疫組織化學(xué)的重大突破。

原位雜交不需要從組織中提取核酸，對于組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性，并可完整地保護組織和細(xì)胞的形態(tài)，更能準(zhǔn)確地反映出組織細(xì)胞的相互關(guān)系及功能狀態(tài)。

惰性多聚體可用來促進250個堿基以上的探針的雜交率。對單鏈探針可增加3倍，而對雙鏈探針、隨機剪切或隨機引物標(biāo)記的探針可增加高達(dá)100倍。而短探針不需用促進劑，因其復(fù)雜度低和分子量小 ，短探針本身的雜交率就高 。硫酸葡聚糖是一種廣泛用于較長雙鏈探針雜交的促進劑。這是一種多聚胺，平均分子量為500 000。另一種常見的促進劑是聚乙二醇（PEG），PEG分子量?。?000～8000）、粘度低、價格低廉，但它不能完成取代硫酸葡聚糖。在某些條件下5%～10%硫酸葡聚糖效果較好，若用5%～10%PEG則可產(chǎn)生很高的本底。因此，使用促進劑時有必要優(yōu)化條件。