細(xì)胞實(shí)驗(yàn)介紹——流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期：

細(xì)胞周期：指細(xì)胞從前一次分裂結(jié)束起到下一次分裂結(jié)束為止的活動(dòng)過(guò)程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期組成。G0/G1期：有絲分裂發(fā)生，細(xì)胞分裂成兩個(gè)細(xì)胞，進(jìn)入下一個(gè)細(xì)胞周期，或者進(jìn)入靜止期（G0期），而G0期從DNA含量上無(wú)法與G1期區(qū)分，細(xì)胞開始RNA和蛋白質(zhì)的合成，但DNA含量仍保持二倍體。S期：DNA開始合成，細(xì)胞核內(nèi)DNA的含量介于G1期和G2期之間。G2期和M期：當(dāng)DNA成為4倍體時(shí)，細(xì)胞進(jìn)入G2期。G2期細(xì)胞繼續(xù)合成RNA及蛋白質(zhì)，直到進(jìn)入M期。

PI法是經(jīng)典的周期檢測(cè)方法。PI為插入性核酸熒光染料，能選擇性的嵌入核酸DNA和RNA雙鏈螺旋的堿基之間與之結(jié)合，其結(jié)合的量與DNA的含量成正比例關(guān)系，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，就可以得到細(xì)胞周期各個(gè)階段的DNA分布狀態(tài)，從而計(jì)算出各個(gè)期的百分含量。

一般流程：細(xì)胞收集-70%酒精固定過(guò)夜-PI染色-流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

細(xì)胞凋亡：細(xì)胞凋亡的早期就有細(xì)胞膜表面破損發(fā)生。破損時(shí)凋亡細(xì)胞表面的磷脂腺絲氨酸(PS)可以從細(xì)胞內(nèi)膜翻轉(zhuǎn)至細(xì)胞的外膜。該過(guò)程發(fā)生在之前，檢測(cè)PS的表達(dá)，能反映早期凋亡。AnnexinV是Ca2 依賴的磷脂結(jié)合蛋白，對(duì)PS有很高的親和性，并且可以與暴露于細(xì)胞外的PS相結(jié)合。利用這一原理，可以將AnnexinV標(biāo)記熒光來(lái)識(shí)別早期的細(xì)胞凋亡。通常利用AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)來(lái)區(qū)分凋亡和壞死細(xì)胞。PI的膜通透性很差，因而只能標(biāo)記壞死的細(xì)胞。

一般流程：細(xì)胞收集-PI-AnnexinV標(biāo)記-流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

結(jié)果示例：

                                   圖 A 細(xì)胞周期檢測(cè)圖；B 細(xì)胞凋亡檢測(cè)圖

Cell Counting Kit-8（簡(jiǎn)稱CCK-8）是一種基于WST-8的廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的檢測(cè)試劑。WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧ji-4-硝ji苯j(luò)i)-3-(4-硝ji苯j(luò)i)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，是一種類似于MTT的化合物，它在電子載體1-甲氧ji-5-甲ji吩嗪鎓硫酸二jia酯（1-Methoxy PMS）存在的情況下，被線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的橙黃色甲瓚產(chǎn)物（formazan）。細(xì)胞增殖越多越快，顏色越深；細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺，對(duì)于同樣的細(xì)胞，顏色的深淺與活xi胞的數(shù)量成正比，因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。

細(xì)胞分化

細(xì)胞分化是指同一來(lái)源的細(xì)胞逐漸產(chǎn)生出形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能特征各不相同的細(xì)胞類群的過(guò)程，其結(jié)果是在空間上細(xì)胞產(chǎn)生差異，在時(shí)間上同一細(xì)胞與其從前的狀態(tài)有所不同。細(xì)胞分化的本質(zhì)是基因組在時(shí)間和空間上的選擇性表達(dá)，通過(guò)不同基因表達(dá)的開啟或關(guān)閉，終產(chǎn)生標(biāo)志性蛋白質(zhì)。細(xì)胞誘導(dǎo)是指將一群不同類型或者形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能特征存在差異的細(xì)胞通過(guò)生物學(xué)、物理學(xué)等手段，將之轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂邢嗨?相同形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能特征的細(xì)胞群體的過(guò)程。