試劑準(zhǔn)備

?1X測(cè)定/裂解緩沖液：短暫混合5X儲(chǔ)備液，并在去離子水中稀釋至1X。 在使用前，添加蛋白酶抑制l劑，例如1 mM PMSF，10 μg / mL亮肽素和10 μg / mL抑肽酶。

1.將細(xì)胞（一塊10厘米長的平板，約107個(gè)細(xì)胞）培養(yǎng)至約80-90％匯合。根據(jù)需要用活化劑或抑制l劑刺激細(xì)胞。

2.吸出培養(yǎng)基，并用冰冷的PBS洗滌兩次。

3.完全除去PBS洗滌液，然后向細(xì)胞中加入冰冷的1X分析/裂解緩沖液（每10 cm組織培養(yǎng)板0.5-1 mL）。

4.將培養(yǎng)板放在冰上10-20分鐘。

5.用刮板將其從平板上取下。

6.將裂解物轉(zhuǎn)移至適當(dāng)大小的試管中，并置于冰上。

7.如果發(fā)生核裂解，則細(xì)胞裂解液可能變得非常粘稠，難以移液。如果發(fā)生這種情況，可將裂解液通過27?號(hào)注l射器針頭3-4次以剪切基因組DNA。

8.通過離心10分鐘（在4°C下為12,000 x g）清除裂解物。

9.收集上清液并將樣品（約1-2 mg的總蛋白）存儲(chǔ)在冰上以立即使用，或速凍并存儲(chǔ)在-70°C以便將來使用。

免l疫印跡和檢測(cè)（所有步驟均在室溫下攪拌）

1.在電印跡步驟之后，將PVDF膜浸入100％甲l醇中15秒鐘，然后使其在室溫下干燥5分鐘。注意：如果使用硝l酸纖維素代替PVDF，則應(yīng)跳過此步驟。

2.在室溫下不斷攪拌下，在TBST中用5％脫脂奶粉或3％BSA封閉膜1小時(shí)。

將膜與抗Arf 6兔多克l隆抗l體在5％脫脂奶粉或3％BSA / TBST中以1：50?1000（取決于樣品中Arf 6蛋白質(zhì)的量）新鮮稀釋，孵育1-在室溫下持續(xù)攪拌2小時(shí)或過夜4oC。

3.用TBST將印跡的膜清洗3次，每次5分鐘。

4.將膜與二抗（例如山羊抗兔IgG，HRP偶聯(lián)物）一起孵育，在室溫下以恒定的比例在5％脫脂奶粉或3％BSA / TBST中以1：1000的比例新鮮稀釋。攪動(dòng)。

5.用TBST將印跡的膜清洗3次，每次5分鐘。

6.使用您選擇的檢測(cè)方法，例如ECL。

電泳和轉(zhuǎn)膜

1. 取15ul樣品/孔上樣17%配體膠。

2. 按照制造商的說明進(jìn)行SDS-PAGE。

3. 按照制造商的說明將凝膠蛋白轉(zhuǎn)到PVDF或硝化纖l維素膜。

免l疫印跡反應(yīng)和檢測(cè)（所有步驟都是在室溫下進(jìn)行，并不斷攪拌）

1. 將PVDF膜浸入100%甲l醇15s，然后在室溫放置5 min晾干。

注意：如果使用的是硝化纖l維素膜，此步省略。

2. 封閉：用TBST緩沖液配制5%的脫脂牛奶或者3%BSA在室溫下孵育1H進(jìn)行封閉，并需要恒定振蕩。

3. 孵育一抗：用TBST緩沖液配制的5%脫脂牛奶或3%BSA稀釋特異性識(shí)別Cdc42活性構(gòu)象的兔多克l隆抗l體（稀釋比例為1:50-1:1000，主要根據(jù)樣品中含有的Cdc42蛋白的量），室溫下孵育1-2小時(shí)，或者4°C條件下過夜孵育。

4. 用TBST緩沖液洗滌膜三次/5min。

5. 孵育二抗：（例如羊抗兔IgG-HRP），用TBST緩沖液配制的5%脫脂牛奶或3%BSA按1:1000稀釋比例稀釋后使用，室溫下孵育1小時(shí)并恒定振蕩。

6. 用TBST緩沖液洗滌膜三次/5min。

7. 使用實(shí)驗(yàn)者所選擇的檢測(cè)方法進(jìn)行顯色如ECL顯色法。