腦組織組化實(shí)驗(yàn)

1. 灌注固定用的針頭，一般都用注射針頭。灌注大鼠一般可用 10 到 12 號(hào)針頭，小鼠可用 6、7 號(hào)針頭，但很重要的一點(diǎn)是要把針頭的磨鈍而不是用銳利的針頭。

2. 關(guān)于穿刺：灌注大鼠時(shí)要把穿刺針的插入到升主動(dòng)脈內(nèi)，但不宜進(jìn)入升主動(dòng)脈過(guò)長(zhǎng)，在動(dòng)脈內(nèi)見(jiàn)到針頭或插入約 1mm 左右即可；灌注小鼠時(shí)只要把針頭插入左心室內(nèi)即可，不必要插入到升主動(dòng)脈內(nèi)。操作的要點(diǎn)是：，操作要迅速，剪開(kāi)膈肌后，迅速沿腋前線(xiàn)剪開(kāi)胸壁，并把胸前壁往上翻，暴露心臟；第二，一定要在明視野下操作，要剪開(kāi)心包壁層的前壁，暴露升主動(dòng)脈和肺動(dòng)脈干的根部，確保穿剌針能進(jìn)入升主動(dòng)脈；第三，穿刺之前要用適當(dāng)大小的血管鉗夾住心室以固定心臟，但不要夾得過(guò)緊，要讓心腔內(nèi)留有一定的間隙，然后在心尖處輕輕旋轉(zhuǎn)針頭插入穿刺針。也可以用小剪刀在心尖處先剪開(kāi)一個(gè)小口再插入穿刺針；第四，穿刺方向要正確，從心尖部開(kāi)始，從左下方斜向右上方，若遇阻力要改變方向再試，不要用力蠻插。

3. 灌注用生理鹽水的量大鼠用 50ml 左右，小鼠用 10ml 左右，一般以從右心耳流出的液體清亮為標(biāo)準(zhǔn)；4% 多聚甲醛用量約相當(dāng)于老鼠體重，如 300 克的老鼠用 300ml 左右。小鼠一般用 20-30ml。灌注速度先快后慢，可持續(xù) 1-2 個(gè)鐘頭，也可以稍快。取腦后置腦塊于 4% 多聚甲醛內(nèi) 4 度后固定 4-6 個(gè)鐘頭。

注意事項(xiàng)

1. 針頭大小與動(dòng)物的種類(lèi)有關(guān)，t 同時(shí)針頭一定要磨鈍。

2. 檢查灌注泵的運(yùn)作情況，一定排出管子的氣泡和空氣，防止空氣栓塞。

3. 經(jīng)腹腔暴腔，先清楚升主動(dòng)脈外面的脂肪組織和心外膜組織。

4. 將針頭經(jīng)左心室插入升主動(dòng)脈（顏色變白的哦），并用鉗子固定。

5. 解開(kāi)右心耳，同時(shí)開(kāi)啟灌注泵。注意，不要隨便揭開(kāi)心臟的其他部位，否則有時(shí)候可能會(huì)灌注成功但是絕大部分會(huì)造成灌注不成功，尤其。

6. 將 4 度的生理鹽水（好已動(dòng)物的發(fā)白為標(biāo)準(zhǔn)，我們實(shí)驗(yàn)室的大鼠約用 250ml）和多聚甲醛 (根據(jù)所取得材料而定) 依次灌入。

7. 整個(gè)過(guò)程均應(yīng)將動(dòng)物放在冰上，以便于更好地保存目的蛋白和酶的活性。

1.3改良多平臺(tái)睡眠剝奪法

在MMPM 中將 10 只大鼠(具體數(shù)目可根據(jù)實(shí)際需要確定)同時(shí)放在裝有 14 或 15 個(gè)臺(tái)的水槽中(長(zhǎng) 127 cm ，寬 44 cm ，高 45 cm )進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，這樣既避免了 SP及M P中單只大鼠與群體隔離的缺點(diǎn)，又保留了 M P 中活動(dòng)范圍增大的特點(diǎn)，因在實(shí)驗(yàn)時(shí)大鼠多是 3 只或 4 只一籠進(jìn)行飼養(yǎng)，如 1 組實(shí)驗(yàn)需 10 只大鼠，則需要3籠或 4籠大鼠，考慮到來(lái)自不同籠的大鼠放在一起實(shí)驗(yàn)也可能造成群體的不穩(wěn)定，有學(xué)者將實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)一步改良，將實(shí)驗(yàn)所需的 10 只大鼠放在同一只籠中飼養(yǎng) 2 周，實(shí)驗(yàn)時(shí)再將這些大鼠放在一起同時(shí)進(jìn)行睡眠剝奪實(shí)驗(yàn)，這樣以克服實(shí)驗(yàn)時(shí)大鼠群體不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，從而將實(shí)驗(yàn)時(shí)的不確定因素減至低! 實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在MMPM中"經(jīng)采取措施保持大鼠群體穩(wěn)定性及避免大鼠與群體分離后" 大鼠上腺重量%體重減輕量%中促上腺皮質(zhì)(A CTH )和上腺皮質(zhì)酮 (CO RT) 的含量均較M P中為低，提示M M PM 較 M P 具有更低的應(yīng)激性，是較為理想的REM 剝奪方法。

3輕柔刺激法

此方法在短期的睡眠剝奪實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用較多，當(dāng)實(shí)驗(yàn)人員通過(guò)觀察大鼠行為或通過(guò)腦電波監(jiān)護(hù)觀察到大鼠進(jìn)入睡眠時(shí)，通過(guò)輕輕拍打大鼠籠子或應(yīng)用聲音、光線(xiàn)的刺激促使大鼠保持清醒，必要時(shí)還可用紙卷、鉛筆或用手直接觸摸大鼠使大鼠無(wú)法進(jìn)入睡眠。注意不能將大鼠移出籠外!此方法簡(jiǎn)單易行，在腦電監(jiān)護(hù)情況下可進(jìn)行 TSD 或 SSD 實(shí)驗(yàn)，在無(wú)腦電監(jiān)護(hù)時(shí)需要實(shí)驗(yàn)人員在旁不間斷觀察大鼠行為，故較適合行短時(shí)間的睡眠剝奪實(shí)驗(yàn)。

4睡眠剝奪法

定時(shí)給大鼠注射， 此類(lèi)方法簡(jiǎn)單易行，操作方便，不需要特殊儀器。缺點(diǎn)是大鼠存在個(gè)體差異， 睡眠剝奪的效果及程度及不易掌握。多用在研究某些特殊藥理作用的實(shí)驗(yàn)中。