選擇素elisa試劑盒的實(shí)驗(yàn)原理

選擇素elisa試劑盒是一類異親型結(jié)合、Ca2 依賴的細(xì)胞粘著分子，能與特異糖基識別并結(jié)合。主要參與白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的識別與粘著。

實(shí)驗(yàn)原理：

將目標(biāo)包被于96孔微孔板中，制成固相載體，向微孔中分別加入品或標(biāo)本，其中的目標(biāo)連接于固相載體上的結(jié)合，然后加入微生物化的目標(biāo)，將未結(jié)合的生物素洗凈后，加入HRP標(biāo)記和親和素，再次徹底洗滌后加入TMB底物顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的。顏色的深淺和樣品中的目標(biāo)呈正相關(guān)。用酶1標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（O.D.值），計算樣品濃度。

精密度：精密度用樣品測定值的變異系數(shù)CV表示。CV（%）=SD/mean×100

批內(nèi)差：取同批次選擇素elisa試劑盒對低、中、高值定值樣本進(jìn)行定量檢測，每份樣本連續(xù)測定20次，分別計算不同濃度樣本的平均值及SD值。

批間差：選取3個不同批次的試劑盒分別對低、中、高值定值樣本定量測定，每個樣本使用同一試劑盒重復(fù)測定8次，分別計算不同濃度樣本的平均值及SD值。

批內(nèi)差： CV<10% Inter-批間差： CV<13%

經(jīng)測定，試劑盒在X期內(nèi)按推薦溫度保存，其活性率小于5%。為減小外部因素對試劑盒前后檢測值的影響，實(shí)驗(yàn)室的條件需盡量保持一致，尤其是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度、濕度及溫育條件。其次由同一實(shí)驗(yàn)員來進(jìn)行操作可人為誤差。

選擇素elisa試劑盒識別的配體都是一些寡糖基團(tuán)，迄今為止發(fā)現(xiàn)的配體都是一些具有唾液酸化路易斯寡糖(s-Le，siaglyl-Lewis)或類似結(jié)構(gòu)的分子。一種寡糖基團(tuán)可以存在多種糖蛋白和糖脂分子上，并分布于多種細(xì)胞表面，因此選擇素分子配體在體內(nèi)分布較為廣泛。

總RNA的抽提方法:

目前常用的方法是用異硫qing酸胍苯1酚抽提法。

提取步驟:

先用液氮研磨材料，勻漿，加入Trizol試劑，進(jìn)一步破碎細(xì)胞并溶解細(xì)胞成分。然后加入氯1仿抽提，離心，分離水相和有機(jī)相，收集含有RNA的水相，通過異丙1醇沉淀，獲得比較純的總RNA,用于下一步mRNA的純化。也可將含有RNA樣品的細(xì)胞破碎液通過硅膠膜純化柱純化。

RNA濃度和純度判斷:

OD260為1時相當(dāng)于濃度為50 ug/mL;

OD260/0D280值在1.8~ 2.0之間，表示純度較好;

0D260/OD280值低于1.8，樣品有蛋白質(zhì)或酚污染;

0D260/0D280值大于2.0，提取的RNA可能有降解;

電泳后如果rRNA大小完整，而且28S rRNA和18SrRNA亮度接近2:1、mRNA分布均勻，則認(rèn)為RNA。

用乙醇沉淀DNA時為什么一定要加NaAc或NaCl

　　在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負(fù)電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl，使Na 中和DNA分子上的負(fù)電荷， 減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太低時， 只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合，這樣就造成DNA沉淀不完全，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太高時， 其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于過多的鹽雜質(zhì)存在，影響DNA的酶切等反應(yīng)，必須要進(jìn)行洗滌或重沉淀。

　　加核糖核酸酶降解核糖核酸后，為什么再要用SDS與KAc來處理?

　　加進(jìn)去的RNase本身是一種蛋白質(zhì)，為了純化DNA，又必須去除之，加SDS可使它們成為SDS-蛋白復(fù)合物沉淀，再加KAc使這些復(fù)合物轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}形式的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，使沉淀更加完全。也可用飽和酚、*抽提再沉淀，去除RNase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到較好效果。

　　在基因操作實(shí)驗(yàn)中，磷酸鹽緩沖系統(tǒng)(pKa=7.2)和硼酸系統(tǒng)(pKa=9.24)等雖然也都符合細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的生理范圍(pH)，可作DNA的保存液，但在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)時，磷酸根離子的種類及數(shù)量將與Ca2 產(chǎn)生Ca3(PO4)2沉淀，在DNA反應(yīng)時，不同的酶對輔助因子的種類及數(shù)量要求不同，有的要求高離子濃度，有的則要求低鹽濃度，采用Tris-HCl(pKa=8.0)的緩沖系統(tǒng)，由于緩沖液是TrisH /Tris，不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時，大都采用Tris-HCl系統(tǒng)，而TE緩沖液中的EDTA更能穩(wěn)定。