1.刺激的和非刺激的細(xì)胞裂解液

2.蛋白酶抑l制劑

3. 4°C管搖桿或搖床

4. 0.5 M EDTA，pH8.0

5. 1 M氯化鎂

6. 2倍還原SDS-PAGE樣品緩沖液

7.電泳和免l疫印跡系統(tǒng)

8.免l疫印跡洗滌緩沖液，例如TBST（10 mM Tris-HCl，pH 7.4，0.15 M NaCl，0.05％

吐溫20）

9.免l疫印跡封閉緩沖液（TBST包含5％脫脂奶粉或3％BSA）

10. PVDF或硝l酸纖維素膜

11.二抗

12. ECL檢測(cè)試劑

免l疫印跡和檢測(cè)（所有步驟均在室溫下攪拌）

1.在電印跡步驟之后，將PVDF膜浸入100％甲l醇中15秒鐘，然后使其在室溫下干燥5分鐘。注意：如果使用硝l酸纖維素代替PVDF，則應(yīng)跳過此步驟。

2.在室溫下不斷攪拌下，在TBST中用5％脫脂奶粉或3％BSA封閉膜1小時(shí)。

將膜與抗Arf 6兔多克l隆抗l體在5％脫脂奶粉或3％BSA / TBST中以1：50?1000（取決于樣品中Arf 6蛋白質(zhì)的量）新鮮稀釋，孵育1-在室溫下持續(xù)攪拌2小時(shí)或過夜4oC。

3.用TBST將印跡的膜清洗3次，每次5分鐘。

4.將膜與二抗（例如山羊抗兔IgG，HRP偶聯(lián)物）一起孵育，在室溫下以恒定的比例在5％脫脂奶粉或3％BSA / TBST中以1：1000的比例新鮮稀釋。攪動(dòng)。

5.用TBST將印跡的膜清洗3次，每次5分鐘。

6.使用您選擇的檢測(cè)方法，例如ECL。

Arf樣蛋白1（Arl1）是GTpases的Ras超家族中的調(diào)控性GTPases Arf家族的成員，并且在整個(gè)真核生物中都具有高度保守的直系同源基因。 Arl1對(duì)果蠅和秀麗隱桿線蟲的早期胚胎發(fā)育至關(guān)重要。 Arl1在主要序列，細(xì)胞定位和功能（膜運(yùn)輸調(diào)節(jié)）上與Arf1-6較相似，甚至共享幾個(gè)共同的結(jié)合伴侶。 除了其在高爾基體/反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)中的膜運(yùn)輸功能中，還有報(bào)道表明Arl1在酵母中的離子穩(wěn)態(tài)中可能發(fā)揮作用。

Arf6激l活測(cè)定。 經(jīng)GDP（lane1）或GTPγS（lane 2）處理后，純化的Arf6蛋白被免l疫沉淀。 用抗活性Arf6單克l隆抗l體進(jìn)行免l疫沉淀。

分析原理

基于構(gòu)型特異性抗Gα13-GTP的NewEast生物科學(xué)Gα13活化檢測(cè)試劑盒從細(xì)胞提取物或體外檢測(cè)活性Gα13-GTP水平的單克l隆抗l體GTPγS負(fù)載Gα13活化試驗(yàn)。簡(jiǎn)單地說，抗活性Gα13小鼠單克l隆抗l體用含有Gα13-GTP的細(xì)胞裂解液培養(yǎng)。結(jié)合的活性Gα13將被蛋白質(zhì)A/G瓊脂糖。用兔抗α13多克l隆抗l體免l疫印跡法檢測(cè)沉淀的活性Gα13。