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生豬屠宰場(chǎng)熒光定量PCR誠信企業(yè)「在線咨詢」

發(fā)布時(shí)間:2020-12-10 05:59  

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廣州勱博儀器有限公司產(chǎn)品服務(wù)包括:非洲病毒檢測(cè)、核酸提取純化、PCR、熒光定量PCR、檢測(cè)、非洲檢測(cè)、全自動(dòng)核酸提取純化系統(tǒng)、病毒核酸提取系統(tǒng)、非洲病毒快速檢測(cè)試劑盒。我們的客戶對(duì)象是食品企業(yè)/公司/廠、食品加工企業(yè)/公司/廠、冷凍食品加工企業(yè)/公司/廠、養(yǎng)殖場(chǎng)、養(yǎng)豬場(chǎng)、屠宰場(chǎng)、生豬屠宰場(chǎng)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-timequantitativePCR,RQPCR)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍,它以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)成為分子生物學(xué)研究中的重要工具。

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據(jù)介紹,該發(fā)明公開了一種非洲病毒 CP530R 基因的熒光 PCR 檢測(cè)試劑及其制備方法與用途,設(shè)計(jì)合成了一套特異性的引物及 Taqman 探針和陽性對(duì)照,并利用該引物及探針建立了一種快速簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、靈敏度高的熒光 PCR 檢測(cè)體系,可在 3~4 小時(shí)內(nèi)從被檢樣本中快速、準(zhǔn)確、特異、安全、簡(jiǎn)便地檢出 ASFV CP530R 基因,可用于來自家豬、和軟蜱的各種樣本中微量非洲病毒CP530R 基因的檢測(cè)。專門的熱循環(huán)儀配備熒光檢測(cè)模塊,用于監(jiān)測(cè)擴(kuò)增時(shí)的熒光,檢測(cè)到的熒光信號(hào)反映了每個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物的量。

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非洲 ( ASF ) 是由非洲病毒 ( ASFV ) 引起豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳i染病。從 20 世紀(jì) 60 和 70 年代i開始 ASF 由非洲蔓延至歐美地區(qū),2007 年格魯吉亞、亞美尼亞、阿塞拜疆和俄羅斯都出現(xiàn)了大面積流行,2018年8月也開始在我國快速蔓延開來,對(duì)我國養(yǎng)豬業(yè)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展構(gòu)成巨大威脅。PCR擴(kuò)增時(shí),Taq酶的5’端-3’端外切酶活性將探針酶切降解,使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離,從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào),即每擴(kuò)增一條DNA鏈,就有一個(gè)熒光分子形成,實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。因此,本方法為快速診斷非洲病毒,提供了有力的技術(shù)手段。



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在PCR擴(kuò)增中,溶液中的模板變性后低溫退火時(shí),引物與探針同時(shí)與模板結(jié)合。在引物的介導(dǎo)下,沿模板向前延伸至探針結(jié)合處,發(fā)生鏈的置換,Taq酶的5′-3′外切酶活性(此活性是雙鏈特異性的,游離的單鏈探針不受影響)將探針5′端連接的熒光基團(tuán)從探針上切割下來,游離于反應(yīng)體系中,從而脫離3′端熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽,接受光刺激發(fā)出熒光信號(hào),即每擴(kuò)增一條DNA鏈,就有一個(gè)熒光分子形成,實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。在real-time技術(shù)的發(fā)展過程中,兩個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)起著關(guān)鍵的作用:(1)在90年代早期,TaqDNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的發(fā)現(xiàn),它能降解特異性熒光記探針,因此使得間接的檢測(cè)PCR產(chǎn)物成為可能。

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直接的方法指的是標(biāo)記熒光的探針與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合后即直接產(chǎn)生熒光,分子信標(biāo)(molecular beacon)就屬于這一類,它本質(zhì)上是一種標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針,當(dāng)探針分子呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)時(shí),結(jié)合在其兩端的熒光基團(tuán)距離上接近,使得產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移效應(yīng),而不發(fā)生熒光。當(dāng)互補(bǔ)序列出現(xiàn)時(shí),探針與DNA雜交,探針轉(zhuǎn)變成一個(gè)開放的結(jié)構(gòu),呈線性,報(bào)告熒光基團(tuán)與淬滅熒光基團(tuán)彼此在空間上產(chǎn)生足夠的分離,熒光基團(tuán)脫離了淬滅基團(tuán)的影響,從而產(chǎn)生可被檢測(cè)到的熒光。廣州勱博--屠宰場(chǎng)熒光定量PCR磁珠法核酸提取,具有傳統(tǒng)DNA提取方法無法比擬的優(yōu)勢(shì),主要體現(xiàn)在:①能夠?qū)崿F(xiàn)自動(dòng)化、大批量操作,符合生物學(xué)高通量的操作要求,使得傳i染性疾病爆發(fā)時(shí)能夠進(jìn)行快速及時(shí)的應(yīng)對(duì),這一特點(diǎn)使得傳統(tǒng)方法望塵莫及。


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相對(duì)常規(guī)PCR而言,熒光定量PCR的主要優(yōu)點(diǎn)是準(zhǔn)確地確定初始模板拷貝數(shù)和寬的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)和高的靈敏度。熒光定量PCR結(jié)果可以用于定性(判斷一段序列的有無),也可以用于定量(確定DNA拷貝數(shù)),即qPCR,而常規(guī)PCR只能做半定量。另外,熒光定量PCR的結(jié)果無需通過瓊脂糖凝膠電泳來評(píng)估,大大節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間,提高實(shí)驗(yàn)效率。還有的在入舍消毒池中,只是例行把水和火堿放進(jìn)去,也不攪拌,火堿靠自身溶解需要較長(zhǎng)時(shí)間,那剛放好的消毒水的作用就不確實(shí)了。還有,由于PCR反應(yīng)和檢測(cè)都在反應(yīng)管中進(jìn)行,樣品污染的幾率大大降低,無需擴(kuò)增后的實(shí)驗(yàn)操作。

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簡(jiǎn)單的講PCR技術(shù)早是用于擴(kuò)增一段特異的PCR片段,用于克i隆、測(cè)序等實(shí)驗(yàn),后來也將其用于樣本中特異的PCR片段有無或相對(duì)定量,而熒光定量PCR技術(shù)則是為了測(cè)定樣本中特異的PCR片段相對(duì)或絕i對(duì)量,是一種測(cè)定特異的PCR片段含量的方式。如測(cè)定病i人樣本中病原體的含量、實(shí)驗(yàn)樣本中某一特定的mRNA的含量等。廣州勱博--養(yǎng)殖場(chǎng)核酸提取純化在PCR反應(yīng)早期,產(chǎn)生熒光的水平不能與背景明顯地區(qū)別,而后熒光的產(chǎn)生進(jìn)入指數(shù)期、線性期和最終的平臺(tái)期,因此可以在PCR反應(yīng)處于指數(shù)期的某一點(diǎn)上來檢測(cè)PCR產(chǎn)物的量,并且由此來推斷模板最i初的含量。有人講過普通PCR后,通過電泳也可以進(jìn)行定量,其實(shí)是將PCR產(chǎn)物的定量與PCR樣本中模板定量相混了。


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非洲為何難以控制?非洲病毒基因組全長(zhǎng) 170~190 kb,為有囊膜的雙鏈 DNA 病毒,病毒粒子大小為 175~215 nm,呈正二十面體結(jié)構(gòu),也是唯i一的蟲媒DNA病毒。非洲病毒是一種急性、熱性、高度接觸性傳i染病,引起豬的死i亡率可達(dá)100%,并且非洲具有潛伏期,即使感i染病毒,但沒有臨床癥狀,就有可能通過非實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)技術(shù)關(guān)卡流入市場(chǎng),進(jìn)而導(dǎo)致下游食品企業(yè)相關(guān)問題的出現(xiàn)。其原理:隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行,PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì),熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。

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非洲與傳統(tǒng)相似且綜合癥狀復(fù)雜難辨,臨床上類似于急性,表現(xiàn)為高熱、皮膚充血、流i產(chǎn)、水腫和臟器出血。我國因之前不屬于非洲i疫情國家,因此沒有相關(guān)的針對(duì)性研究,目前采用的是原農(nóng)i業(yè)部檢疫所于1997年與美國梅島動(dòng)物病研究所共同研究的檢測(cè)方法,主要是PCR和ELISA,標(biāo)準(zhǔn)遵循GB/T 18648-2002非洲診斷技術(shù)。隨著相關(guān)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展,對(duì)于非洲的檢測(cè)方法也更加完善。熒光定量PCR結(jié)果可以用于定性(判斷一段序列的有無),也可以用于定量(確定DNA拷貝數(shù)),即qPCR,而常規(guī)PCR只能做半定量。PCR技術(shù)是目前i簡(jiǎn)單、快速的分子學(xué)檢測(cè)方法,但該方法的敏感性有限,因此以PCR為基礎(chǔ)的更新方法應(yīng)運(yùn)而生。