原位雜交試驗(yàn)

收集斑馬魚(yú)的胚胎，在Holfretor水中培養(yǎng)，到達(dá)所需要的發(fā)育時(shí)期時(shí)，用蛋白酶去除卵膜，用4%多聚甲醛固定，在4℃保存，二十四小時(shí)后用50%甲6醇2%多聚甲醛溶液洗，然后換成甲9醇，在-20C 保存，待用(兩天和兩天以上的胚胎需要用雙氧6水處理，去除色素?；蛘呤褂帽斤畴逑∪芤号囵B(yǎng)，可阻斷色素的形成)

原位雜交中探針的選擇

DNA探針、RNA探針和寡核苷酸探針均能通過(guò)不同的酶促分子反應(yīng)進(jìn)行標(biāo)記。寡核苷酸探針的長(zhǎng)度較短，因此避免了探針內(nèi)部退火的問(wèn)題，在雜交時(shí)的滲透能力也更好，探針與靶標(biāo)的接觸這是影響原位雜交是否成功的重要因素之一。DNA探針、RNA探針在合成時(shí)需要控制探針片段長(zhǎng)度，通常300-1000bp左右，能覆蓋到較長(zhǎng)片段的靶核酸序列，增加檢測(cè)的靈敏度。

雜交液中的陽(yáng)離子濃度通過(guò)靜電排斥作用影響了雜交體之間的鏈穩(wěn)定性，較高的鹽濃度將增加雜交體的穩(wěn)定性。大于0.4M的Na離子濃度，對(duì)Tm值、雙鏈復(fù)性速率的影響不大，但隨著Na離子濃度的降低，將顯著影響Tm值和雙鏈復(fù)性速率。

有2機(jī)溶2劑（甲酰胺）的作用是降低DNA-DNA和DNA-RNA等雙鏈體的解鏈溫度。通常DNA需要在0.1~0.2M Na 90~100℃的條件下變性，那么應(yīng)用于原位雜交，樣品必須在65~75℃的條件下進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間變性，這將導(dǎo)致樣品形態(tài)學(xué)的破壞。50%甲酰胺的應(yīng)用能將雜交溫度降至30~45℃。

硫酸葡聚糖具有很強(qiáng)的水合性，高濃度的硫酸葡聚糖會(huì)使得核酸分子無(wú)法獲得周邊親水環(huán)境，增加了探針濃度，加快雜交反應(yīng)速率。