原位雜交技術基本原理

原位雜交技術的基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補的堿基序列，將有放6射性或非放6射性的外源核酸(即探針)與組織、細胞或染色體上待測DNA或RNA互補配對，結合成專一的核酸雜交分子，經(jīng)一定的檢測手段將待測核酸在組織、細胞或染色體上的位置顯示出來。

為顯示特定的核酸序列必須具備3個重要條件：組織、細胞或染色體的固定、具有能與特定片段互補的核苷酸序列(即探針)、有與探針結合的標記物。

原位雜交組織（或細胞）化學技術簡稱原位雜交（In situ hybridization, ISH）是應用已知堿基順序并帶有標記物的核酸探針與組織細胞內(nèi)待測的核酸，按堿基互補配對原則進行特異性結合，形成雜交體，然后用與標記物相應的檢測系統(tǒng)，通過組織化學或免3疫組織化學方法在核酸原有位置進行細胞內(nèi)定位、定性和定量研究。為分子水平研究細胞內(nèi)基因表達及有關細胞5因子的調(diào)控提供了有效的工具?？梢暈榻M織化學與免3疫組織化學的重大突破。

原位雜交不需要從組織中提取核酸，對于組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性，并可完整地保護組織和細胞的形態(tài)，更能準確地反映出組織細胞的相互關系及功能狀態(tài)。

在條件都得到滿足的情況下，雜交的成敗就取決于保溫時間。時間短了，雜交反應不完成；時間長了也無益，會引起非特異結合增多。一般雜交反應要進行20h左右。1966年Britten和Kohne推薦用Cot =值來計算雜交反應時間。Cot 值實際上是雜交液中單鏈起始濃度（Co）和 反應時間（t）的乘積。實驗表明Cot =100時，雜交反應基本完成。Cot=0，基本上沒有雜交。例如在液相雜交中未標記的DNA 400μg/ml（按單股DNA每微克 紫外吸收值為0.024計算，總的吸收值為 9.6），如果反應時間為21h，那么對于未標記的DNA來說，Cot =9.6/21 =100.8,，雜交完成了。對標記DN A（濃度為0.1μg/ml）來說Cot值為0.05，這就充分排除了標記DNA的自我復性。Tm值25℃時雜交zui佳，所以首先要根據(jù)公式（4）計算雜交體Tm 值。由此式可見，通過調(diào)節(jié)鹽濃度、甲酰胺濃度和雜交溫度來控制所需的嚴格性。



根據(jù)不同的雜交實驗要求，應選擇不同的核酸探針。在大多數(shù)情況下，可以選擇克0隆的DNA或cDNA雙鏈探針。但是在有些情況下，必須選用其它類型的探針如寡核苷酸探針和RNA探針。例如，在檢測靶序列上的單個堿基改變時應選用寡核苷酸探針，在檢測單鏈靶序列時應選用與其互補的DNA單鏈探針（通過克0隆人M13噬菌體DNA獲得）或RNA探針，寡核苷酸探針也可。長的雙鏈DNA探針特異性較強，適宜檢測復雜的靶核苷酸序列和病原體 ，但不適宜于組織原位雜交，因為它不易透過細胞膜進入胞內(nèi)或核內(nèi)。在這種情況下，寡核苷酸探針和短的PCR標記探針（80～150bp）具有較大的優(yōu)越性。