PCR法不僅僅局限于分子生物學，還因其簡便、迅速等特點被廣泛應用于醫(yī)學、法醫(yī)學、食品、環(huán)境衛(wèi)生檢驗、動植物檢驗等其它領域。Taq DNA聚合酶是PCR法普遍使用的聚合酶，但其具有如下局限性。

1. 可信度 (Fidelity)：通常Taq DNA Polymerase的Fidelity并不高，PCR反應有時會出現(xiàn)錯配 (Misincorporation) 現(xiàn)象，因而PCR克1隆、變異導入等實驗中，需加以注意。

2. 擴增的DNA長度：使用Taq DNA Polymerase進行PCR擴增時，通?？蓴U增幾kb的DNA，超過10 kb則比較困難。這就給利用PCR進行Mapping等Genome解析帶來麻煩。

3. 擴增量：使用Taq DNA Polymerase進行PCR產(chǎn)物克1隆及食品、環(huán)境衛(wèi)生檢驗等時，擴增量常常達不到要求。為解決以上難題，Takara在對Polymerase、Buffer及反應條件等進行深入研究的基礎上，開發(fā)了LA PCR (Long and Accurate PCR) 技術，運用此技術可大量正確地擴增長達40 kb 的DNA部分片段。LA PCR技術擴展了PCR的應用范圍，可在Genome解析、基因診斷、長片段 DNA的克1隆及變異導入等方面發(fā)揮優(yōu)勢。

LA PCR的原理

LA PCR的關鍵是具有3′→5′Exonuclease活性 (Proof reading活性) 的耐熱性DNA聚合酶。在PCR過程中當有錯誤的堿基攝入時，反應性能將大幅度下降，TaKaRa Ex Taq 和TaKaRa LA Taq 依靠3′→5′Exonuclease活性可將錯配的堿基除去，從而延伸反應能順利地進行下去，使長鏈DNA的擴增成為可能。

出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。

引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設計引物。

靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。

復合PCR(multiplex PCR)技術

在同一反應中用多組引物同時擴增幾種基因片段.如果基因的某一區(qū)段有缺失則相應的電泳譜上這一區(qū)帶就會消失。復合PCR主要用于同一病原體的分型及同時檢測多種病原體、多個點突變的分子病的診斷。

重組PCR技術

重組PCR技術是在兩個PCR擴增體系中,兩對引物分別由其中之一在其5°-端和3-端引物上帶.上一段互補的序列混合兩種PCR擴增產(chǎn)物.經(jīng)變性和復性。兩組PCR產(chǎn)物互補序列發(fā)生粘連。其中一條重組雜合鏈能在PCR條件下發(fā)生聚合延伸反應，產(chǎn)生一個包含兩個不同基因的雜合基因。