反相色譜影響因素(1)柱長有機(jī)小分子和肽類的分辨率隨柱長的增加而增加．但是柱長增加并不能使蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的分辨率顯著增加．它們在較短的柱子上往往也有很好的分離效果。(2)流動(dòng)相的流速。有機(jī)小分子和肽類的分辨率對流動(dòng)相流速非常敏感。而蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的分辨率則不然。流速越小，柱子越長，色譜峰的寬度就越大，分辨率就越小。制備色譜上樣過程中的流速對動(dòng)態(tài)吸附容量影響很大。(3)溫度。溫度上升，流動(dòng)相黏度下降，流動(dòng)速度加快，且流動(dòng)相與固定相之間的傳質(zhì)速度加快，使分辨率增加。如果沒有氣泡，就要重新檢查一氣裝置和流量控制器等是否正確設(shè)置，并檢查一下整個(gè)氣路有無泄漏。同時(shí)，溫度上升，分子熱運(yùn)動(dòng)增加，疏水性作用減弱。升高溫度要考慮目標(biāo)物質(zhì)的熱穩(wěn)定性。(4)流動(dòng)相組成。流動(dòng)相的極性越大，溶質(zhì)的分配系數(shù)越大，洗脫時(shí)間越長。RPC多采用降低流動(dòng)相極性(水含量)的線性梯度洗脫法。水是極性強(qiáng)的溶劑，在反相色譜中常常和基礎(chǔ)溶劑配合使用，向流動(dòng)相中加入不同濃度的、可以與水混溶的有機(jī)溶1劑，以得到不同強(qiáng)度的流動(dòng)相，這些有機(jī)溶1劑稱為修飾劑。反相色譜中的有機(jī)溶1劑。此外，乙醇、四氫呋1喃、異丙1醇及二氧六環(huán)也常被用作修飾劑。有機(jī)溶1劑梯度的大小也會(huì)影響分辨率，一般梯度越小，分辨率越大。

使用儀器不當(dāng)：只要互相有10%比例就不會(huì)出現(xiàn)這個(gè)問題。另一原因是在用緩沖液鹽溶液（不論甲1醇含量有多少）作流動(dòng)相時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后沒有換甲1醇水沖洗，使得微滲的流動(dòng)相干燥形成晶體造成。不過，輸送泵漏液并不是非得馬上修不可，沖洗干凈并在以后的使用中多加小心一般都可以正常使用。色譜柱大家都不陌生，是我們做分析的必需品，無論是液相色譜儀還是氣相色譜儀都離不開色譜柱。檢測器漏液是個(gè)很麻煩的事，一般都是吸收池的問題，更換的費(fèi)用相當(dāng)高。但是并不是說一定要馬上更換，還可以從實(shí)際實(shí)驗(yàn)效果看能否湊合使用。

液相色譜儀維護(hù)排查主要指的是定期對儀器常用的耗材，部件進(jìn)行檢查、更換和維護(hù)。色譜柱管一般是玻璃或聚合物材料的，長度一般為240-440mm，內(nèi)徑為10-40mm。常見的耗材維護(hù)包括氣體凈化裝置（除水、除氧和除烴裝置）、氣相色譜儀進(jìn)樣口進(jìn)樣墊（進(jìn)樣隔墊、注射墊）、襯管、O型圈、分流部件（分流平板、毛細(xì)柱適配器）和分流捕集阱等，氣相色譜儀部件維護(hù)則主要包括色譜柱的老化、FID檢測器噴嘴、收集極的清洗，ECD的高溫老化等。     液相色譜儀在安裝時(shí)要考慮到室內(nèi)的溫度和濕度，控制在溫度為5--35℃，濕度控制在0--85%的范圍內(nèi)，保持恒溫、恒濕。只有這樣，儀器才能發(fā)揮的性能，才能保證儀器的使用壽命。

色譜柱中的流動(dòng)相會(huì)排干嗎？　　不少做色譜分離試驗(yàn)的人遇到過這樣的情形：不慎未及時(shí)補(bǔ)充流動(dòng)相，泵將溶劑瓶中的流動(dòng)相吸干了，HPLC系統(tǒng)由此而停止工作了。如此情況是否會(huì)損壞色譜柱？泵是否已將色譜柱中所有流動(dòng)相都排干了？色譜柱還能使用嗎？事實(shí)上，如果泵將溶劑瓶中的流動(dòng)相吸干，并不會(huì)造成色譜柱的損壞。如果檢測器內(nèi)有殘留氣泡，會(huì)有特別明顯的表現(xiàn)形式，就是在走基線時(shí)會(huì)時(shí)不時(shí)間隔出現(xiàn)直上直下信號很大的信號峰。即使泵中充滿了空氣，泵也不會(huì)將空氣排入色譜柱。因?yàn)楸弥荒茌斔鸵后w，而不能輸送空氣。相比之下，另一個(gè)更可能發(fā)生的情況是忘記蓋上色譜柱兩端的密封蓋或蓋子太松而使色譜柱變干。同樣，整個(gè)色譜柱干涸的情況不太容易發(fā)生，多半可能只是色譜柱兩端的幾個(gè)毫米變干了，因揮發(fā)掉所有溶劑是色譜柱變干需要相當(dāng)長的時(shí)間。即使色譜柱真的變干了，也不一定就不可救藥了?？梢試L試用一種完全脫氣的、表面張力低的溶劑沖洗色譜柱以除去氣體。較低的表面張力有助于浸潤填料表面；已脫氣的溶劑應(yīng)該能夠溶解并去除滯留在填料中的氣體。色譜柱大約需要沖一個(gè)小時(shí)或更多的時(shí)間被徹底浸潤，恢復(fù)到正常狀態(tài)。