當(dāng)前沒有直接測定法來測量Arl1 GTPases的激l活。

NewEast Biosciences Arl1激l活檢測試劑盒基于特定于配置的單克l隆抗l體，該抗l體特異性識別Arl1-GTP，但不能識別Arl1-GDP。 鑒于單克l隆抗l體對其抗原的高度親和力，可以在短時間內(nèi)進(jìn)行激l活測定。 該測定法可提供可靠的結(jié)果，并具有一致的可重復(fù)性。

試劑盒成分

特異性識別Cdc42活性構(gòu)象的鼠單克l隆抗l體（Anti-active Cdc42, Mouse MonoclonalAntibody (Catalog No. 26905)）：小管裝--30ul (抗l體濃度是1mg/ml)，抗l體溶于PBS（pH7.4）并包含50%的甘油和0.05%的疊氮l化鈉。此抗l體可以特異性識別所有脊椎動物中的Cdc42-GTP。

Protein A/G agarose (Catalog No. 30301) ：小管裝—400ul包含200ul Protein A/G agarose     和200ul 20%乙醇溶液。（使用時溶液需要充分混勻，再吸取）

5X Assay/Lysis Buffer (Catalog No. 30303)：小瓶裝—30mL包含250 mM Tris-HCl (pH 8.0),     750 mM NaCl, 50 mM MgCl2, 5 mM EDTA, 5% Triton X-100。

特異性識別Cdc42活性構(gòu)象的兔多克l隆抗l體（Anti-Cdc42, Rabbit Polyclonal Antibody  (Catalog No.21010)）：小管裝--30ul (抗l體濃度是1mg/ml)，抗l體溶于PBS（pH 7.4）并包含有   50%的甘油。

100 X GTPγS (Catalog No. 30302) ：小管裝—100ul (10 mM) ，實驗中0.5mL細(xì)胞裂解液使用      5ul GTPγS標(biāo)記。

100 X GDP (Catalog No. 30304) ：小管裝—100ul (100 mM) ，實驗中0.5mL細(xì)胞裂解液使用5ul GDP標(biāo)記。

電泳和轉(zhuǎn)膜

1. 取15ul樣品/孔上樣17%配體膠。

2. 按照制造商的說明進(jìn)行SDS-PAGE。

3. 按照制造商的說明將凝膠蛋白轉(zhuǎn)到PVDF或硝化纖l維素膜。

免l疫印跡反應(yīng)和檢測（所有步驟都是在室溫下進(jìn)行，并不斷攪拌）

1. 將PVDF膜浸入100%甲l醇15s，然后在室溫放置5 min晾干。

注意：如果使用的是硝化纖l維素膜，此步省略。

2. 封閉：用TBST緩沖液配制5%的脫脂牛奶或者3%BSA在室溫下孵育1H進(jìn)行封閉，并需要恒定振蕩。

3. 孵育一抗：用TBST緩沖液配制的5%脫脂牛奶或3%BSA稀釋特異性識別Cdc42活性構(gòu)象的兔多克l隆抗l體（稀釋比例為1:50-1:1000，主要根據(jù)樣品中含有的Cdc42蛋白的量），室溫下孵育1-2小時，或者4°C條件下過夜孵育。

4. 用TBST緩沖液洗滌膜三次/5min。

5. 孵育二抗：（例如羊抗兔IgG-HRP），用TBST緩沖液配制的5%脫脂牛奶或3%BSA按1:1000稀釋比例稀釋后使用，室溫下孵育1小時并恒定振蕩。

6. 用TBST緩沖液洗滌膜三次/5min。

7. 使用實驗者所選擇的檢測方法進(jìn)行顯色如ECL顯色法。