熒光分光光度計(jì)測(cè)試注意事項(xiàng)

①樣品應(yīng)盛在四面透光的石英比色皿（熒光池）中，如果是揮發(fā)性樣品應(yīng)使用帶塞的熒光池。

②在熒光分析時(shí)，為了得到穩(wěn)定且可靠的數(shù)據(jù)，一般需要開機(jī)預(yù)熱氙燈大約30min。如果儀器光源采用的是閃爍氙燈，預(yù)熱時(shí)間可以縮短到10min左右。對(duì)某些易感光、易分解的熒光物質(zhì)，盡量采用長(zhǎng)波長(zhǎng)、低人射光強(qiáng)度及短時(shí)間光照。

③溫度變化可引起熒光強(qiáng)度的改變。通常降低溫度，有利于提高熒光量的子產(chǎn)率，熒光強(qiáng)度增大。溫度影響熒光強(qiáng)度的顯著程度因樣品而異，大部分熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度受溫度影響不大，測(cè)試溫度變化不超過±3℃，對(duì)測(cè)試結(jié)果幾乎無影響。

④當(dāng)熒光物質(zhì)是弱酸或弱堿時(shí)，溶液的pH對(duì)熒光強(qiáng)度有較大影響。因?yàn)槿跛峄蛉鯄A在不同酸度中，分子和離子的電離平衡會(huì)發(fā)生改變，而熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度會(huì)因其離解狀態(tài)發(fā)生改變。

⑤分子結(jié)構(gòu)中存在π-π共軛的熒光物質(zhì)在極性溶劑中，熒光效率顯著增強(qiáng)。溶液中表面活性劑的加入能夠顯著提高熒光強(qiáng)度。

⑥瑞利散射和拉曼散射是溶劑的兩種散射光，應(yīng)注意不要誤把瑞利散射和拉曼散射光譜當(dāng)做熒光光譜。瑞利散射光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)相同，拉曼散射與激發(fā)光波長(zhǎng)不同，而熒光物質(zhì)的熒光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)無關(guān)，因此可以通過選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長(zhǎng)將拉曼散射光與熒光分開。在測(cè)試時(shí)選擇合適的狹縫寬度，或者空白扣除，也可以對(duì)散射光的影響進(jìn)行校正。

⑦熒光物質(zhì)分子與溶液中其它物質(zhì)分子之間作用導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低，常見的熒光猝滅劑，如鹵素離子、重金屬離子、硝基化物質(zhì)、重氮化合物等。

⑧測(cè)試過程中注意不要肉眼盯著氙燈光源看，以防眼睛造成損傷。

⑨儀器房應(yīng)注意經(jīng)常通風(fēng)，避免產(chǎn)生的臭氧在室內(nèi)富集。

熒光光譜儀

根據(jù)波茲曼 （Boltzmann）分布，分子在室溫時(shí)基本上處于 電子能級(jí)的基態(tài)。當(dāng)吸收了紫外-可見光后，基態(tài)分子中的電子只能躍遷到激發(fā)單重態(tài)的各個(gè)不同振動(dòng)-轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)，根據(jù)自旋禁阻選律, 不能直接躍遷到激發(fā)三重態(tài)的各個(gè)振動(dòng)-轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)。處于激發(fā)態(tài)的分子是不穩(wěn)定的，通常以輻射躍遷和無輻射躍遷等方式釋放多余的能 量而返回至基態(tài)，發(fā)射熒光是其中的一條途徑。振動(dòng)弛豫（vibrational relexation）是處于激發(fā)態(tài)各振動(dòng)能級(jí)的分子通過與溶劑分子的碰攛而將部分振動(dòng)能量傳遞給溶劑分子，其電子則返回到同一電子激發(fā)態(tài)的低振動(dòng)能級(jí)的過程。由于能量不是以光輻射的形式放出，故振動(dòng)弛豫屬于無輻射躍遷。振動(dòng)弛豫只能在同一電子能級(jí)內(nèi)進(jìn)行，發(fā)生振動(dòng)弛豫的時(shí)間約為 秒數(shù)量級(jí)。內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換（ internal conversion）簡(jiǎn)稱內(nèi)轉(zhuǎn)換，是當(dāng)兩個(gè)電子激發(fā)態(tài)之間的能量相差較小以致其振動(dòng)能級(jí)有重疊時(shí)，受激分子常由高電子能級(jí)以無輻射方式轉(zhuǎn)移至低電子能級(jí)的過程。

熒光分析的特點(diǎn)

靈敏度高：熒光分析的特點(diǎn)是靈敏度高，通常情況下要比分光光度計(jì)的靈敏度高出2-3個(gè)數(shù)量級(jí)。

選擇性強(qiáng)：包括激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，在鑒定物質(zhì)時(shí)，通過選擇波長(zhǎng)可以使分子熒光分析有多種選擇。

試樣量少和方法簡(jiǎn)便。

能提供比較多的物理參數(shù)：如激發(fā)光譜、發(fā)射光譜、熒光強(qiáng)度、產(chǎn)率、熒光壽命、熒光偏振等參數(shù)。這些參數(shù)反映了分子的各種特性，并通過它們可以得到被檢測(cè)分子的更多信息。

熒光壽命

熒光壽命與物質(zhì)所處微環(huán)境的極性、黏度等有關(guān)，可以通過熒光壽命分析直接了解所研究體系發(fā)生的變化。熒光現(xiàn)象多發(fā)生在納秒級(jí)，這正好是分子運(yùn)動(dòng)所發(fā)生的的時(shí)間尺度，因此利用熒光技術(shù)可以“看”到許多復(fù)雜的分子間作用過程，例如超分子體系中分子間的簇集、固液界面上吸附態(tài)高分子的構(gòu)象重排、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化等。熒光壽命分析在光伏、法醫(yī)分析、生物分子、納米結(jié)構(gòu)、點(diǎn)、光敏作用、鑭系元素、光動(dòng)力等領(lǐng)域均有應(yīng)用。

熒光壽命的測(cè)定技術(shù)有時(shí)間分辨單光計(jì)數(shù)技術(shù)(TCSPC)、相調(diào)法、閃頻法。其中TCSPC具有靈敏度高、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、系統(tǒng)誤差小的優(yōu)點(diǎn)，是目前的的熒光壽命測(cè)定方法。