多彩色熒光原位雜交技術(shù)多彩色熒光原位雜交(Multicolor fluorescence in situ hybridization，mFISH)是在熒光原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新技術(shù)，它用幾種不同顏色的熒光素單獨(dú)或混合標(biāo)記的探針進(jìn)行原位雜交，能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶位，各靶位在熒光顯微鏡下和照片上的顏色不同，呈現(xiàn)多種色彩，因而被稱為多彩色熒光原位雜交。它克服了FISH技術(shù)的局限，能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因，在檢測(cè)遺傳物質(zhì)的突變和染色體上基因定位等方面得到了廣泛的應(yīng)用(楊明杰等1998)。

雜交液中的陽離子濃度通過靜電排斥作用影響了雜交體之間的鏈穩(wěn)定性，較高的鹽濃度將增加雜交體的穩(wěn)定性。大于0.4M的Na離子濃度，對(duì)Tm值、雙鏈復(fù)性速率的影響不大，但隨著Na離子濃度的降低，將顯著影響Tm值和雙鏈復(fù)性速率。

有2機(jī)溶2劑（甲酰胺）的作用是降低DNA-DNA和DNA-RNA等雙鏈體的解鏈溫度。通常DNA需要在0.1~0.2M Na 90~100℃的條件下變性，那么應(yīng)用于原位雜交，樣品必須在65~75℃的條件下進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間變性，這將導(dǎo)致樣品形態(tài)學(xué)的破壞。50%甲酰胺的應(yīng)用能將雜交溫度降至30~45℃。

硫酸葡聚糖具有很強(qiáng)的水合性，高濃度的硫酸葡聚糖會(huì)使得核酸分子無法獲得周邊親水環(huán)境，增加了探針濃度，加快雜交反應(yīng)速率。

惰性多聚體可用來促進(jìn)250個(gè)堿基以上的探針的雜交率。對(duì)單鏈探針可增加3倍，而對(duì)雙鏈探針、隨機(jī)剪切或隨機(jī)引物標(biāo)記的探針可增加高達(dá)100倍。而短探針不需用促進(jìn)劑，因其復(fù)雜度低和分子量小 ，短探針本身的雜交率就高 。硫酸葡聚糖是一種廣泛用于較長(zhǎng)雙鏈探針雜交的促進(jìn)劑。這是一種多聚胺，平均分子量為500 000。另一種常見的促進(jìn)劑是聚乙二醇（PEG），PEG分子量?。?000～8000）、粘度低、價(jià)格低廉，但它不能完成取代硫酸葡聚糖。在某些條件下5%～10%硫酸葡聚糖效果較好，若用5%～10%PEG則可產(chǎn)生很高的本底。因此，使用促進(jìn)劑時(shí)有必要優(yōu)化條件。


在條件都得到滿足的情況下，雜交的成敗就取決于保溫時(shí)間。時(shí)間短了，雜交反應(yīng)不完成；時(shí)間長(zhǎng)了也無益，會(huì)引起非特異結(jié)合增多。一般雜交反應(yīng)要進(jìn)行20h左右。1966年Britten和Kohne推薦用Cot =值來計(jì)算雜交反應(yīng)時(shí)間。Cot 值實(shí)際上是雜交液中單鏈起始濃度（Co）和 反應(yīng)時(shí)間（t）的乘積。實(shí)驗(yàn)表明Cot =100時(shí)，雜交反應(yīng)基本完成。Cot=0，基本上沒有雜交。例如在液相雜交中未標(biāo)記的DNA 400μg/ml（按單股DNA每微克 紫外吸收值為0.024計(jì)算，總的吸收值為 9.6），如果反應(yīng)時(shí)間為21h，那么對(duì)于未標(biāo)記的DNA來說，Cot =9.6/21 =100.8,，雜交完成了。對(duì)標(biāo)記DN A（濃度為0.1μg/ml）來說Cot值為0.05，這就充分排除了標(biāo)記DNA的自我復(fù)性。Tm值25℃時(shí)雜交zui佳，所以首先要根據(jù)公式（4）計(jì)算雜交體Tm 值。由此式可見，通過調(diào)節(jié)鹽濃度、甲酰胺濃度和雜交溫度來控制所需的嚴(yán)格性。