原位雜交是指將特定標(biāo)記的已知順序核酸為探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進(jìn)行雜交，從而對(duì)特定核酸順序進(jìn)行精3確定量定位的過(guò)程。原位雜交可以在細(xì)胞標(biāo)本或組織標(biāo)本上進(jìn)行。

原位雜交技術(shù)(In situ hybridization，ISH)是分子生物學(xué)、組織化學(xué)及細(xì)胞學(xué)相結(jié)合而產(chǎn)生的一門(mén)新興技術(shù)，始于20世紀(jì)60年代。

原位PCR；原位雜交細(xì)胞定位和PCR的高靈敏度相結(jié)合的技術(shù)，在細(xì)胞（爬片、甩片或涂片）或組織（石蠟、冰凍切片）上直接對(duì)靶基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)摻入標(biāo)記基團(tuán)直接顯色或結(jié)合原位雜交進(jìn)行檢測(cè)的方法。

多種探針標(biāo)記檢測(cè)系統(tǒng)

基于地高3辛、生物素和熒光標(biāo)記分子的標(biāo)記和檢測(cè)系統(tǒng)是常見(jiàn)的原位雜交檢測(cè)方法。

熒光標(biāo)記檢測(cè)常為直接探針標(biāo)記方法，如在dUTP/UTP/ddUTP上連接Fluorescein后進(jìn)行核酸標(biāo)記。由于標(biāo)記在核酸上的熒光分子必須經(jīng)受雜交和洗脫過(guò)程中的考驗(yàn)，以及熒光分子易于衰減，其檢測(cè)靈敏度受到一定的影響。但對(duì)熒光分子的直接檢測(cè)呈現(xiàn)的背景較低。

雜交技術(shù)zui重要的因素之一是選擇zui適的雜交反應(yīng)溫度。若反應(yīng)溫度低于Tm 10～15℃，堿基順序高度同源的互補(bǔ)鏈可形成穩(wěn)定的雙鏈，錯(cuò)配對(duì)減少。若反應(yīng)溫度再低（Tm-30℃），雖然互補(bǔ)鏈之間也可形成穩(wěn)定的雙鏈，但互補(bǔ)堿基配對(duì)減少，錯(cuò)配對(duì)增多、氫鍵結(jié)合的更弱。如兩個(gè)同源性在50%左右或更低些的DNA，調(diào)整雜交溫度可使它們之間的雜交率變化10倍，因此在實(shí)驗(yàn)前必須首先確定雜交溫度。通常有三種溫度可供試驗(yàn)，即zui適復(fù)性溫度、苛刻復(fù)性溫度及非苛刻復(fù)性溫度。溫度的選擇及溫度對(duì)雜交的影響見(jiàn)表18-3。

zui適復(fù)性溫度（Optimunm renaturation temperature, TOR）：Tor =Tm –25℃

苛刻復(fù)性溫度：Ts = Tm – (10或15℃)

非苛刻復(fù)性溫度：Tns =Tm – (30或35℃)