PCR出現(xiàn)假陰性

不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及Br乙錠的使用， ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。

模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制1劑，③模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時(shí)丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改。

LA PCR的原理

LA PCR的關(guān)鍵是具有3′→5′Exonuclease活性 (Proof reading活性) 的耐熱性DNA聚合酶。在PCR過程中當(dāng)有錯(cuò)誤的堿基攝入時(shí)，反應(yīng)性能將大幅度下降，TaKaRa Ex Taq 和TaKaRa LA Taq 依靠3′→5′Exonuclease活性可將錯(cuò)配的堿基除去，從而延伸反應(yīng)能順利地進(jìn)行下去，使長鏈DNA的擴(kuò)增成為可能。

競爭性PCR(competitive PCR, c-PCR技術(shù)

c-PCR技術(shù)是競爭cDNA模板與目的cDNA同時(shí)擴(kuò)增.使用同樣的引物,但一經(jīng)擴(kuò)增后。能從這些目的cDNA區(qū)別開來。通常使用突變性競爭cDNA模板.其序列與目的cDNA序列相同.不過模板中僅有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)或缺少內(nèi)切位點(diǎn)突變性的cDNA模板可用適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶水解,并用分光計(jì)測定其濃度。cDNA目的序列和競爭模板相對應(yīng)的含量.可用澳化乙錠染色.電泳膠直接掃描進(jìn)行測定或摻入放1射性同位素標(biāo)記的方法測定。競爭模板開始時(shí)的濃度是已知的.則cDNA目的序列的zui初濃度就能測定。這種方法能準(zhǔn)確測定mRNA中cDNA靶序列.可用于幾個(gè)到10個(gè)細(xì)胞中mRNA的定量。

 PCR反應(yīng)五要素

參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物(PCR引物為DNA部分片段,細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)1制的引物為一段RNA鏈)、酶、dNTP、模板和緩沖液(其中需要Mg2 )。

[PCR步驟]標(biāo)準(zhǔn)的PCR過程分為三步:

1.DNA變性(90°C-96*C): 雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA

2.退火(25C-65'C): 系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。

3.延伸(70°C-75*C): 在Taq酶(在72C左右，活性zui佳)的作用下，以dNTP為原料，從引物的5'端→3'端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。

每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍?，F(xiàn)在有些PCR因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是zui佳也能在很短的時(shí)間內(nèi)copy完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時(shí)在60°C -65C間進(jìn)行，以減少一次升降溫過程，提

高了反應(yīng)速度。