低溫生物知多少？

實(shí)驗(yàn)室的傳代保藏過程

1. 按說明書要求復(fù)溶菌粉，轉(zhuǎn)種于適當(dāng)?shù)脑鼍囵B(yǎng)基內(nèi)（G1），復(fù)壯后轉(zhuǎn)接至平板上，并于適當(dāng)溫度下培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間，分離出單個(gè)純種菌落，此為第2代（G2）。

2. 鑒定完成后，挑取純菌落制成濃菌懸液用于制備甘油冷凍管，同時(shí)挑取純菌落轉(zhuǎn)接斜面作為工作用。此時(shí)，保藏為第2代，但工作用則為第三代。

3. 將第2代管冷凍保存，將工作用于適當(dāng)溫度下培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間后可用于試驗(yàn)。

4. 取一支冷凍保存的G2代轉(zhuǎn)種于平板和斜面培養(yǎng)基上，平板上的制成冷凍保藏管第三代（G3），斜面培養(yǎng)基經(jīng)適當(dāng)溫度下培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間后用作工作用（W3）。

5. 將第三代（G3）冷凍或低溫保存，將生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)種后的G2經(jīng)滅菌處理后丟棄。

6. 當(dāng)工作用代數(shù)小于5時(shí)，可直接用上一代工作用轉(zhuǎn)接下一代工作用，如W3可直接轉(zhuǎn)接為W4。

7. 按上述程序操作，直至G4轉(zhuǎn)為W5為止，需重新開啟安瓿，再重復(fù)上述操作程序、保藏和使用。

以上方法中，被分為兩類。傳代用和工作用，傳代用用于甘油冷凍管法保藏，工作用用斜面低溫保藏法保藏。

實(shí)驗(yàn)證明，甘油冷凍管的有效期至少為2年，但其主要適用于細(xì)菌（需氧）、酵母菌的傳代、保藏、真菌和芽孢類細(xì)菌則需應(yīng)用其它方法。

低溫生物菌種的發(fā)展趨勢(shì)

生產(chǎn)成本低、應(yīng)用效果好

我國(guó)長(zhǎng)期大量施用化肥，使單位化肥量的增產(chǎn)量下降，因此有效合理施用化肥，提高化肥利用率已成為一個(gè)重要課題。因此，增加有機(jī)肥、微生物肥料的施用不再是權(quán)宜之計(jì)，而是降低農(nóng)民投入，提高產(chǎn)品品質(zhì)、減少環(huán)境污染，取得較大的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和生態(tài)效益的一項(xiàng)有效措施。

生產(chǎn)無(wú)公害食品、減少環(huán)境污染的需求

無(wú)公害食品對(duì)當(dāng)今的農(nóng)業(yè)提出了更高的要求。人們對(duì)農(nóng)產(chǎn)品的數(shù)量和質(zhì)量也提出來更高的要求。隨著國(guó)內(nèi)外積極發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)(生態(tài)農(nóng)業(yè))，生產(chǎn)安全、無(wú)公害的食品成為一個(gè)發(fā)展趨勢(shì)，這就為開發(fā)生產(chǎn)好品質(zhì)的微生物肥料提供一個(gè)好的發(fā)展機(jī)遇。并且由于濫用化肥引起的土壤質(zhì)量下降，地下水污染等問題日益突出，無(wú)污染的微生物肥料的綜合作用更顯示出它的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)和良好的發(fā)展前景 。

低溫生物菌種——常用菌種介紹

側(cè)孢芽孢菌

在延遲期， 短芽孢菌為革蘭氏染色陰性，菌體呈細(xì)長(zhǎng)的桿狀；在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，為革蘭氏染色陽(yáng)性，菌體成短而粗的桿狀；在靜止期，革蘭氏染色又轉(zhuǎn)為陰性，菌體成細(xì)長(zhǎng)的桿狀，偶爾也能觀察到橢圓形的芽孢。圖1是50號(hào)菌用1%H2SO4(pH6.8)負(fù)染后的電鏡照片：菌體桿狀、周生鞭毛、大小約0.88μm×2.2μm。

作為非脊椎動(dòng)物的病原菌，有關(guān)研究人員曾報(bào)道了這種細(xì)菌的殺線蟲能力，由于所報(bào)道的這些側(cè)孢短芽孢菌菌株都不產(chǎn)生伴孢晶體，所以這些菌株的殺線蟲毒力因子并非來自于具有特征性的伴孢晶體。然而，Smirnova TA，et al.分離到了2株能形成大的伴孢晶體的側(cè)孢短芽孢菌菌株，這兩株菌顯示出很強(qiáng)的殺昆蟲能力，研究證實(shí)，這種能力與菌體在形成芽孢過程中的伴孢晶體相關(guān)。有趣的是，Singer的實(shí)驗(yàn)表明，一株側(cè)孢短芽孢菌的殺線活性源于一個(gè)熱穩(wěn)定蛋白的毒性。所有這些研究表明，不同側(cè)孢短芽孢菌菌株擁有不同的線蟲致病因子。牛秋紅研究小組分離到的側(cè)孢短芽孢菌G4菌株具有顯著的殺線蟲功能，但其并不產(chǎn)生伴孢晶體。從該菌株的發(fā)酵液里提取的粗蛋白酶液在12h內(nèi)能殺掉所有測(cè)試線蟲并在24h內(nèi)完全降解。從側(cè)孢短芽孢菌G4菌株中純化出的絲氨酸胞外蛋白酶可水解多種底物，包括膠原和線蟲體壁，具有很強(qiáng)的殺線蟲能力，組織病理電鏡實(shí)驗(yàn)證實(shí)這種蛋白酶嚴(yán)重破壞了線蟲體壁。而且，蛋白酶將線蟲體壁分解成為一些氨基酸或小肽，這些營(yíng)養(yǎng)物使病原細(xì)菌更好的生長(zhǎng)繁殖。該蛋白酶基因異源表達(dá)的菌株表現(xiàn)出了明顯的殺線蟲活性，重組蛋白酶在體外對(duì)線蟲體壁降解，而蛋白酶缺失菌株喪失了大部分的殺線活性，死的線蟲在生測(cè)中保持了完整的體壁，表明蛋白酶在線蟲侵染中起主要作用。

生物菌種存活必備條件

1、保持土壤合理濕度

高溫悶棚前，菜農(nóng)多進(jìn)行土壤翻耕，使得澆水水量極大，土壤濕度過高，通透性差，影響生物菌的增殖。因此，悶棚澆水時(shí)，要先起壟，澆小水保證土壤較為濕潤(rùn)即可，不要大水漫灌。

2、閉棚后不要立即升溫

底肥需要生物菌發(fā)酵，若翻入土壤后立即澆水升溫，多數(shù)菌種被扼殺，僅有少量嗜熱菌可以存活，但糞肥發(fā)酵僅靠嗜熱菌是完成不了的。

建議菜農(nóng)翻地澆水后間隔幾天，待土壤濕度降低，生物菌大量繁殖后再覆蓋地膜、關(guān)閉通風(fēng)口進(jìn)行悶棚，此時(shí)低溫菌種已經(jīng)發(fā)揮作用，可以產(chǎn)生大量熱量輔助悶棚，可大大改善悶棚效果。

3、促進(jìn)生物菌快速繁殖

想要促進(jìn)微生物快速增殖，可使用菌種含量高的菌劑，例如20億的，可充分發(fā)揮菌劑作用。菜農(nóng)要學(xué)會(huì)換位思考，生物菌喜歡什么樣的條件，就創(chuàng)造什么樣的條件，如此才能確保悶棚效果。