熒光定量PCR儀的技術原理

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所謂real-time Q-PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基因，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。在 real-time 技術的發(fā)展過程中，兩個重要的發(fā)現(xiàn)起著關鍵的作用：（1）在90年代早期，TaqDNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的發(fā)現(xiàn)，它能降解特異性熒光記探針，因此使得間接的檢測PCR產物成為可能。（2）此后熒光雙標記探針的運用使在一密閉的反應管中能實時地監(jiān)測反應全過程。這兩個發(fā)現(xiàn)的結合以及相應的儀器和試劑的商品化發(fā)展導致real-time Q-PCR方法在研究工作中的運用。

熒光定量PCR儀的產前診斷應用

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到目前為止，人們對遺傳性物質改變引起的遺傳性疾病還無法治，只能通過產前監(jiān)測，減少病嬰出生，以防止各類遺傳性疾病的發(fā)生，如為減少X連鎖遺傳病患兒的出生，從孕婦的外周血中分離胎兒DNA，用實時熒光定量PCR檢測其Y性別決定區(qū)基因是一種無創(chuàng)傷性的方法，易為孕婦所接受。

熒光定量PCR的原理

PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；剛開始時, 探針結合在DNA任意一條單鏈上;PCR擴增時，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步?；蛘呤褂脽晒馊玖蟂YBR。SYBR可以結合到雙鏈DNA上面，當體系中的模板被擴增時，SYBR可以有效結合到新合成的雙鏈上面，隨著PCR的進行，結合的SYBR染料越來越多，被儀器檢測到的熒光信號越來越強，從而達到定量的目的。