如何用制備色譜柱制備低含量的雜質(zhì)？

制備色譜柱為ZorbaxSB-C18 9.4*250mm及gilson餾分收集器，色譜儀為Agilent1100或LC-6A。想用其制備面積歸一化法含量為0.05%左右的雜質(zhì)，初步提純后用高分辨的LC-MS進(jìn)行定性分析。如何設(shè)定色譜條件，如，流量、進(jìn)樣量、樣品的濃度、切割點(diǎn)的設(shè)置、是否要濃縮，要求將95%以上的主峰切除。

（主峰后有二個(gè)雜質(zhì)靠得很近。）

答：

1.制備用的流動(dòng)相盡量等級(jí)高一點(diǎn)，否則流動(dòng)相中的雜質(zhì)會(huì)影響LC-MS分析。

2.使用餾分收集器時(shí)，延遲體積一定要計(jì)算準(zhǔn)確，檢測器的響應(yīng)時(shí)間設(shè)到很小，否則都會(huì)影響收集的純度和回收率。制備柱的流速一般與直徑的平方成正比，如果4.6mm分析柱流速為1mL/min，9.4mm制備柱用1*（9.4/4.6）2,大約為4mL/min。進(jìn)樣量設(shè)到幾個(gè)mg應(yīng)該基本沒有過載。進(jìn)樣樣品濃度越高越好。假如進(jìn)樣10mg，理論計(jì)算0.05%的雜質(zhì)大約只有5μg，顯然濃度太低，盡量是多做幾次，合并餾分然后濃縮后做LC-MS分析。

多肽的分離制備,如何上量？如何增大分離度?

反相HPLC應(yīng)當(dāng)是很好的分離小肽方法，用CH3CN或CH3OH：H2O（95：5）做流動(dòng)相，看保留如何，若無保留，建議改用其他色譜方法進(jìn)行分離。

關(guān)于多肽的分離，首先要知道它的分子量大小，然后選擇不同類型的填料，如孔徑的大小。我們先在分析柱（4.6mm內(nèi)徑）上做一下實(shí)驗(yàn),找到很大的分離度,這一過程的難度是很大的,要不斷地改變流動(dòng)相和固定相,然后再線性或非線性放大到制備,放大的倍數(shù)按分析柱的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。分離后可以通過冷凍干燥得到固體。

還可以考慮離子交換來分l離。

制備色譜之DAC如何次次裝出高柱效

動(dòng)態(tài)軸向壓縮柱（Dynamic Axial Compression Column，DAC）是工業(yè)化制備液相色譜分離的重要組成部分。當(dāng)用戶填裝直徑50mm以上制備柱時(shí)，傳統(tǒng)預(yù)裝柱很難裝出高柱效和對(duì)稱性，另外預(yù)裝柱使用過程柱頭容易塌陷，導(dǎo)致柱效變差，無法滿足長期持續(xù)純化生產(chǎn)。DAC在運(yùn)行過程中，活塞可以提供持續(xù)壓力，保證很優(yōu)的填裝柱床密度和穩(wěn)定性，從而長時(shí)間保持很佳分離效果。相比于預(yù)裝柱或彈簧柱，DAC可以輕松填裝和拆卸，實(shí)現(xiàn)不同填料反復(fù)填裝和輕松切換。有人說大柱子不用考慮柱效和對(duì)稱性，只要能分出樣品就行?，F(xiàn)實(shí)是色譜就是靠柱效來分離的，柱效越高，分離越好，載量越大，收率和得率越高。

通常制備色譜方法開發(fā)在4.6mm，10mm或20mm的半制備柱，然后放大到DAC50或DAC100, DAC200，DAC300, DAC450, DAC600或DAC800。理論上多大規(guī)模的色譜柱都可以實(shí)現(xiàn)與分析柱或半制備柱同樣的效率，在現(xiàn)實(shí)中，設(shè)計(jì)優(yōu)良的DAC柱效甚至高于預(yù)裝柱。只有柱效和對(duì)稱性類似才能保證了分離方法的線性放大。

工業(yè)制備色譜

用于制備和生產(chǎn)的大規(guī)模生物分離技術(shù)所面臨的問題是:如何在不破壞目標(biāo)蛋白質(zhì)的生物活性的前提下(溫和的條件)，以很高的識(shí)別性，以及較高的分離能力和收率，經(jīng)濟(jì)有效地從稀溶液中提取、分離、純化目標(biāo)產(chǎn)物。吸附通?？梢栽诔?、水相、適當(dāng)?shù)膒H、離子強(qiáng)度、避免使用等有害的化學(xué)試劑等溫和的條件下操作，液相色譜具有很高的分離性能，適合于生物分離過程的要求。