試劑準(zhǔn)備

?1X測(cè)定/裂解緩沖液：短暫混合5X儲(chǔ)備液，并在去離子水中稀釋至1X。 在使用前，添加蛋白酶抑制l劑，例如1 mM PMSF，10 μg / mL亮肽素和10 μg / mL抑肽酶。

1.將細(xì)胞（一塊10厘米長的平板，約107個(gè)細(xì)胞）培養(yǎng)至約80-90％匯合。根據(jù)需要用活化劑或抑制l劑刺激細(xì)胞。

2.吸出培養(yǎng)基，并用冰冷的PBS洗滌兩次。

3.完全除去PBS洗滌液，然后向細(xì)胞中加入冰冷的1X分析/裂解緩沖液（每10 cm組織培養(yǎng)板0.5-1 mL）。

4.將培養(yǎng)板放在冰上10-20分鐘。

5.用刮板將其從平板上取下。

6.將裂解物轉(zhuǎn)移至適當(dāng)大小的試管中，并置于冰上。

7.如果發(fā)生核裂解，則細(xì)胞裂解液可能變得非常粘稠，難以移液。如果發(fā)生這種情況，可將裂解液通過27?號(hào)注l射器針頭3-4次以剪切基因組DNA。

8.通過離心10分鐘（在4°C下為12,000 x g）清除裂解物。

9.收集上清液并將樣品（約1-2 mg的總蛋白）存儲(chǔ)在冰上以立即使用，或速凍并存儲(chǔ)在-70°C以便將來使用。

當(dāng)前沒有直接測(cè)定法來測(cè)量Arl1 GTPases的激l活。

NewEast Biosciences Arl1激l活檢測(cè)試劑盒基于特定于配置的單克l隆抗l體，該抗l體特異性識(shí)別Arl1-GTP，但不能識(shí)別Arl1-GDP。 鑒于單克l隆抗l體對(duì)其抗原的高度親和力，可以在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行激l活測(cè)定。 該測(cè)定法可提供可靠的結(jié)果，并具有一致的可重復(fù)性。

Gα13活化試驗(yàn)。MEF細(xì)胞分別用LPA（第2道）或不加LPA（1道）處理。細(xì)胞裂解物用抗活性Gα13單克l隆抗l體（Cat）孵育。#26902）（頂面板）。這個(gè)用抗Gα13兔多克l隆抗l體（Cat）免l疫印跡法檢測(cè)沉淀活性Gα13#21005年）。底部的面板顯示了用抗Gα13的細(xì)胞裂解物的Western blot（5%在頂部面板中使用的）。